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Resumen

La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Resumen

Uno de los mecanismos para subvertir el efecto de los medicamentos por el parásito de la malaria es a través del recableado de su transcriptoma. El efecto es más pronunciado en el caso de los genes diana que pertenecen a la familia multigénica. Las proteínas quinasas de Plasmodium falciparum pertenecientes a la familia CDPK son esenciales para el desarrollo de la etapa sanguínea. Como tales, las CDPK se consideran buenos objetivos para el desarrollo de compuestos antipalúdicos. El enfoque de la genética química se ha utilizado históricamente para dilucidar la función de las proteínas quinasas en los eucariotas superiores. Requiere la sustitución del residuo guardián por otro aminoácido con una cadena lateral diferente a través de la manipulación genética. La sustitución de aminoácidos en la posición de guardián modula la actividad de una proteína quinasa y cambia su susceptibilidad a una clase específica de compuestos conocidos como inhibidores de la quinasa (BKI) que ayudan en la identificación funcional del gen objetivo. Aquí, hemos explotado el enfoque de la genética química para comprender los mecanismos compensatorios evolucionados por un parásito mutante que alberga un alelo hipomórfico de cdpk1. En general, nuestro enfoque ayuda a identificar vías compensatorias que pueden ser dirigidas simultáneamente para prevenir el desarrollo de resistencia a los medicamentos contra quinasas individuales.

Introducción

La malaria es una de las principales enfermedades infecciosas que causa millones de muertes cada año, especialmente en niños menores de 5 años1. No existe una vacuna clínicamente disponible contra la malaria. Además, se sabe que el Plasmodium falciparum, el parásito más mortal de la malaria humana, ha adquirido resistencia contra el fármaco de primera línea llamado artemisinina 2,3,4,5. Existe una necesidad urgente de identificar nuevos objetivos farmacológicos y estrategias novedosas que puedan desplegarse rápidamente para evitar la propagación de la resistencia a la artemisinina en todo el mundo. Una mejor comprensión del mecanismo de acción de los fármacos y de las bases moleculares de las vías compensatorias puede ayudar a diseñar mejores estrategias para evitar el desarrollo de resistencia a los fármacos.

Las proteínas quinasas que pertenecen a la familia de las proteínas quinasas dependientes del calcio (CDPKs) son cruciales en muchas etapas del desarrollo del parásito durante las etapas eritrocítica, sexual y preeritrocita6. Durante la replicación asexual de P. Se sabe que falciparum, CDPK5 desempeña un papel crítico en la salida de merozoítos de esquizontes maduros7. La deleción condicional de CDPK5 no permite que los esquizontes liberen merozoítos en el torrente sanguíneo, lo que provoca la muerte del parásito. El mecanismo molecular de la salida del parásito mediada por CDPK5 no se comprende completamente y se cree que involucra a la proteína quinasa G (PKG) como regulador aguas arriba 7,8. CDPK7 es esencial para la maduración de los parásitos en fase de anillo a trofozoíto9. CDPK4 es otro miembro de la familia CDPK que es fundamental para el desarrollo de la etapa sexual dentro de los mosquitos. Está involucrado en múltiples pasos durante el proceso de exflagelación y, por lo tanto, es crítico para la formación de gametos masculinos libres y móviles 10,11,12,13. CDPK1 fosforila, componentes del complejo de membrana interna y roftría 14,15. Además, la deleción condicional de CDPK1 da lugar a la hipofosforilación de las proteínas implicadas en la invasión de los glóbulos rojos16. Se ha demostrado que CDPK1 regula la descarga de orgánulos apicales durante el proceso de invasión17. CDPK1 también ayuda en la salida de merozoítos de glóbulos rojos infectados mediante la fosforilación de la proteasaSERA5 18. La CDPK1 fosforilada se localiza preferentemente en el extremo apical del merozoíto, donde puede interactuar con otras proteínas del parásito necesarias para el proceso de invasión19,20. CDPK1 también está involucrada en la formación de gametos masculinos y femeninos, lo cual es un paso crítico para la transmisión de la malaria y el desarrollo sexual del parásito dentro de los mosquitos21.

El enfoque de la genética química ha sido utilizado históricamente para la identificación de los roles funcionales de las quinasas de los mamíferos22,23. El enfoque utiliza la sustitución de un residuo en la posición de guardián con un aminoácido de una cadena lateral diferente. El cambio de residuo de guardián modula el tamaño de una bolsa de ATP adyacente que, a su vez, cambia la accesibilidad de los compuestos químicos llamados inhibidores de la quinasa (BKI) hacia la enzima mutante en comparación con el tipo salvaje. La sustitución de un residuo voluminoso en la posición del guardián de acceso por un residuo más pequeño permite el acceso a los BKI, mientras que la sustitución inversa hace que la quinasa sea resistente a los BKI. En algunos casos, la sustitución del residuo gatekeeper se asocia con una disminución de la actividad quinasa de la enzima diana, lo que hace que la modificación sea intolerante para los estudios funcionales24,25. El efecto negativo de la sustitución de guardianes en la actividad enzimática puede revertirse generando una mutación supresora en un segundo sitio en la quinasaintolerante 25. Se ha utilizado un enfoque de genética química para estudiar la función de las proteínas quinasas de Apicomplexan. El CDPK4 de tipo salvaje que contenía un residuo guardián más pequeño fue inhibido selectivamente por los inhibidores de quinasas BKI-1 y 1294, lo que llevó a un bloqueo en la gametogénesis masculina y el desarrollo de ooquistes11,12. La sustitución de un pequeño residuo guardián en CDPK4 por un residuo voluminoso de metionina condujo a una disminución de la inhibición mediada por BKI en la exflagelación11. Se demostró que CDPK1 de Toxoplasma gondii, un parásito apicomplejo estrechamente relacionado con el parásito de la malaria, está involucrado en la motilidad y la invasión de las células huésped por taquizoítos26,27. Se aprovechó un bolsillo guardián más pequeño de la TgCDPK1 de tipo salvaje para diseñar inhibidores específicos que disminuyeron la patogénesis de la enfermedad en modelos animales28,29. Participación de P. falciparum La proteína quinasa G (PKG) en el desarrollo esquizogónico tardío y la formación de gametos se demostró mediante la inhibición de la actividad de la enzima mediante inhibidores farmacológicos específicos30,31. La sustitución de la treonina en la posición de guardián por glutamina (T618Q) disminuyó en gran medida la sensibilidad de la enzima mutante a los inhibidores, lo que resultó en una gametogénesis normal y en la progresión del esquizonte al anillo30,31.

La mayoría de los estudios previos han utilizado un enfoque de genética química para la caracterización funcional de las quinasas diana 11,12,22,23,26,30,31, sin embargo, hemos adoptado este enfoque para comprender el desarrollo de mecanismos compensatorios en parásitos que albergan un alelo hipomórfico de una proteína quinasa. Anteriormente demostramos que la sustitución del residuo guardián de tipo salvaje en CDPK1 con metionina (T145M) da como resultado una disminución de ~ 47% en el potencial de transfosforilación de la enzima mutante32. Un parásito mutante que contiene el alelo hipomórfico de cdpk1 (cdpk1t145m) está preadaptado para la actividad reducida de CDPK1 mediante el recableado transcripcional de otros miembros de la familia CDPK. Creemos que esta estrategia puede ser utilizada en general para dilucidar los mecanismos compensatorios en parásitos mutantes que contienen alelos hipomórficos de proteínas quinasas esenciales. Otras quinasas que compensan parcialmente la función de la quinasa diana pueden inhibirse simultáneamente junto con la quinasa diana para prevenir el desarrollo de resistencia a los fármacos contra cinasas individuales. Esto puede servir como una mejor estrategia para el control de la malaria.

Protocolo

La P. La cepa del parásito falciparum (NF54) se obtuvo de Álvaro Molina Cruz 21,32,33. Los glóbulos rojos humanos O+ utilizados para el cultivo del parásito se obtuvieron del Centro Rotario de Sangre de Nueva Delhi (India). Los plásmidos, pL6eGFP y pUF1, se obtuvieron de José-Juan López-Rubio. El DSM267 se obtuvo de Margaret A. Phillips y Pradipsinh K. Rathod. WR99210 fue proporcionado por Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Construcción de un plásmido para la expresión de CDPK1 recombinante en Escherichia coli

  1. Diseñar el par de cebadores de oligonucleótidos para amplificar el CDS completo del gen cdpk1 (acceso PlasmoDB no. PF3D7_0217500) Utilizar software de análisis de cebadores.
    1. Amplificar el CDS completo utilizando ADN polimerasa con un par de oligonucleótidos específicos del gen: Pk1fpgex y Pk1rpgex (véase la Tabla 1) utilizando ADNc preparado a partir de Plasmodium falciparum como molde en un volumen de reacción de 20 μL. Establecer las condiciones de amplificación de la PCR de la siguiente manera: Desnaturalización inicial a 98 °C durante 2 min, (Desnaturalización a 98 °C durante 30 s, Recocido a 52 °C durante 20 s, Extensión a 62 °C durante 20 s) x 36, Extensión final a 62 °C durante 10 min. Almacene el producto PCR a 4 °C hasta su uso posterior.
  2. Digiera 1 μg del producto de PCR amplificado y 1 μg del plásmido de expresión pGEX4T1 con endonucleasas de restricción BamHI (20.000 U/mL) y NotI (20.000 U/mL) durante 3-4 h a 37 °C en un volumen total de reacción de 30 μL.
  3. Para purificar el producto de PCR de doble digestión y el plásmido, utilice un kit de limpieza de PCR basado en columna y siga las instrucciones del fabricante.
  4. Ligue 100 ng de plásmido pGEX4T1 purificado y de doble digestión con un inserto en una relación molar vector-inserto de 1:5 utilizando 1 μL de ADN ligasa T4 en un volumen total de reacción de 10 μL. Incubar la reacción de ligadura a 16 °C durante la noche.
  5. Transformar E. Coli Células competentes DH5α con la mezcla ligada siguiendo el protocolo del fabricante y placa en placas de agar LB que contienen ampicilina (100 μg/mL).
  6. Cribado de cuatro clones bacterianos obtenidos de la transformación para detectar la presencia del plásmido recombinante purificando el plásmido mediante un mini kit de purificación de plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Confirme el plásmido recombinante mediante digestión de doble restricción utilizando BamHI y NotI, como se describe anteriormente en el paso 1.3.
  7. Verifique aún más los clones positivos para la digestión de restricción para la secuencia correcta mediante secuenciación de ADN de Sanger. Transformar E. Coli BLR(DE3) Células competentes para pLysS con la construcción de plásmido verificada por secuencia para la expresión de la proteína CDPK1.

2. Expresión y purificación de la proteína CDPK1 recombinante en E. coli

  1. Expresión de CDPK1 recombinante
    1. Inocular un solo clon de E. Coli BLR(DE3) cepa pLysS que contiene la construcción de plásmido verificado por secuencia en 10 mL de medio LB que contiene ampicilina (100 μg/mL). Incubar el cultivo durante la noche a 37 °C con agitación a 200-250 rpm.
    2. Inocular el cultivo secundario con el 1% del cultivo primario y dejar que las células bacterianas crezcan hasta la fase logarítmica media a 37 °C. Cuando la densidad óptica (DO) del cultivo secundario alcanza 0,7-0,9 a 600 nm, inducir la expresión del CDPK1 recombinante de longitud completa añadiendo 1 mM de isopropil ß-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar durante 10-12 h a 24 °C.
    3. Después de la incubación, coseche el E. Coli por centrifugación a 5.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y retener el pellet de la célula.
    4. Prepare el tampón de lisis con la siguiente composición: 1 mM de ditiotreitol (DTT), 0,1 mg/mL de lisozima, 1 mM de EDTA, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y un cóctel de inhibidores de proteasa 1x en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    5. Vuelva a suspender el pellet de celda en 10 veces el volumen de peso del pellet del tampón de lisis. Sonicar la suspensión celular durante 15 min en intervalos de 9 s encendido, 15 s apagado para evitar el calentamiento localizado que puede conducir a la desnaturalización de las proteínas.
    6. Centrifugar el lisado a 17.000 x g durante 1 h e incubar el sobrenadante transparente con perlas de glutatión durante la noche a 4 °C. Siga el protocolo que se menciona a continuación para obtener la proteína CDPK1 recombinante purificada.
  2. Cromatografía de afinidad con perlas de glutatión para la purificación de CDPK1 marcado con GST
    1. Tome 500 μL de perlas de glutatión completamente resuspendidas para 250 mL de cultivo bacteriano y centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Decanta cuidadosamente el sobrenadante.
    2. Lave las perlas con 5 mL de tampón aglutinante (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,3) e inviértalas para mezclar.
    3. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Repita el lavado y la centrifugación durante 3x-4x.
    4. Añadir las perlas al lisado celular de bacterias e incubar durante 12 h a 4 °C con una ligera agitación (20-30 rpm).
    5. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. El sobrenadante se puede guardar para estimar la cantidad de CDPK1 recombinante que permanece sin unir.
    6. Lave las perlas unidas a CDPK1 al menos 5-6 veces con PBS que contenga 1 mM de DTT, seguido de un lavado con 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, pH 7,5.
    7. Eluir la proteína unida 2 veces primero con 250 μL de tampón de elución 1 (EB1) seguido de 2x con 250 μL de tampón de elución 2 (EB2). La composición de EB1 y EB2 es de 10 mM de glutatión reducido en 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, pH 7,5 y 20 mM de glutatión reducido en 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl y pH de 7,5, respectivamente.
    8. Incubar las perlas unidas a CDPK1 en tampones de elución 1 y 2 a temperatura ambiente (RT) durante 5-10 min utilizando una agitación suave o una rotación de extremo a extremo.
    9. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y transferir cuidadosamente el sobrenadante que contiene la proteína recombinante CDPK1 eluida en un tubo separado.
    10. Repita los pasos 2.2.8 y 2.2.9 para obtener 2 eluidos cada uno con EB1 y EB2.

3. Mutagénesis dirigida al sitio para la generación de proteínas mutantes recombinantes CDPK1

  1. Utilice el plásmido pGEX4T1 que contiene el gen cdpk1 verificado por secuencia. Preferimos usar el mismo plásmido que se usó para la transformación de la cepa pLysS de E. coli BLR(DE3).
  2. Diseñe los cebadores para introducir una mutación de guardián en la secuencia del gen cdpk1 de tipo salvaje. El residuo guardián de tipo salvaje (T145) está codificado por un codón ACC en el gen cdpk1 . Reemplace el guardián de la treonina con residuos de guardián pequeños (serina, T145S) y voluminosos (metionina, T145M) codificados por codones AGC y ATG, respectivamente.
  3. Siga las pautas que se mencionan a continuación para diseñar los cebadores directos e inversos para la mutagénesis dirigida al sitio.
    1. Asegúrese de que ambos cebadores sean complementarios entre sí. Mantenga 15-20 nucleótidos de secuencia no modificada en ambos lados de la mutación. Asegúrese de que Tm esté entre 50 °C y 55 °C para la secuencia, excluyendo el sitio mutado.
  4. Utilice el kit de mutagénesis dirigida al sitio para generar las construcciones mutantes de guardián de acceso de cdpk1. Siga las instrucciones del fabricante para introducir la mutación deseada. En la Tabla 1 se enumeran los cebadores utilizados para la mutagénesis dirigida al sitio.
  5. Trate la mezcla de reacción con 0,5 μL de DpnI (20.000 U/mL) de la enzima para digerir el plásmido metilado parental. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 3 h. Transformar las células competentes de E. coli DH5α con la mezcla de reacción tratada con DpnI.
  6. Cribado de cuatro clones de cada uno de los constructos de plásmidos T145M y T145S para verificar la introducción de la mutación deseada en la secuencia del gen cdpk1 a través de la secuenciación del ADN.
  7. Transformar los plásmidos verificados por secuencia en la cepa pLysS de E. coli BLR(DE3) para la expresión de las proteínas recombinantes CDPK1 T145M/S como se describe en el paso 1.5.
  8. Exprima y purifique las proteínas mutantes guardianas CDPK1 siguiendo los pasos descritos en la sección 2 para la proteína CDPK1 de tipo salvaje.

4. Ensayo de actividad quinasa in vitro de CDPK1

NOTA: La actividad de la quinasa de CDPK1 recombinante de tipo salvaje y las proteínas mutantes guardianas se evalúa mediante un enfoque de marcado de epítopos semisintéticos como lo describe Allen et al.34.

  1. Incubar 50 ng de proteína recombinante en el tampón que contiene 50 mM de Tris, 50 mM de MgCl2, 1x cóctel de inhibidores de fosfato con 2 μg de proteína básica de mielina (MBP) como sustrato exógeno de CDPK1 en la mezcla total de reacción de 50 μL.
  2. Dependiendo de las condiciones que requieran la presencia o ausencia de calcio, agregue CaCl2 o EGTA, respectivamente para obtener la concentración final de 2,5 mM cada uno en el tampón de ensayo de quinasa. Añada ATPγS a la concentración final de 100 μM al tampón para utilizarlo como fuente del grupo fosfato terminal transferible.
  3. Incubar la mezcla de reacción a 30 °C en un baño de agua durante 1 h, seguido de la terminación de la reacción mediante la adición de 5 mM de EGTA. Añadir 5 μl de 50 mM de mesilato de p-nitrobencil (PNBM) a la mezcla de reacción y dejar incubar a 20 °C en un baño de agua durante 2 h para la alquilación de los residuos de serina y treonina fosforilados en la transfosforilación MBP y CDPK1 autofosforilado.
  4. Al total de 55 μL de mezcla de reacción, agregue 19 μL de tampón de muestra SDS 4x y caliente a 95 °C durante 5 min.

5. Análisis de Western blot para detectar los productos tiofosforilados del ensayo de quinasa in vitro

  1. Prepare el gel SDS-PAGE al 12% y cargue 15 μL de cada muestra. Separe la mezcla de reacción para visualizar el CDPK1 autofosforilado y el MBP transfosforilado.
  2. Transfiera las proteínas separadas del gel SDS-PAGE a una membrana de PVDF utilizando el método de transferencia húmeda32.
  3. Bloquee los sitios inespecíficos de la membrana de PVDF incubándola con leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris (20 mM de Tris-HCL, pH 7,5, 150 mM de NaCl) que contenga 0,05% de Tween 20 durante 1 h en RT.
  4. Incubar la membrana de PVDF con el anticuerpo primario de conejo contra los aductos tiofosforilados alquilados en una dilución de 1:2.500 durante la noche a 4 °C en el tampón de bloqueo.
  5. Después de la incubación durante la noche, lave la mancha 3 veces con solución salina tamponada con Tris con 0.05% Tween 20 durante 10 minutos cada una.
  6. Incubar el blot con anticuerpo secundario anti-conejo de cabra en tampón de bloqueo a una dilución de 1:5.000 durante 1 h en RT, seguido de un lavado con solución salina tamponada con Tris que contenga 0,05% de Tween 20.
  7. Superponga la mancha con un sustrato quimioluminiscente mezclando una proporción igual de solución A y solución B de acuerdo con las instrucciones del fabricante y exponga en una película de rayos X en una habitación oscura para obtener señales de autofosforilación de CDPK1 y transfosforilación de MBP.

6. Clonación de la secuencia guía para la selección dellocuscdpk1 para introducir la sustitución del gatekeeper  

NOTA: La secuencia guía de 20 nucleótidos se seleccionó mediante curación manual y se clonó en el plásmido pL6eGFP en el sitio BtgZI empleando los siguientes pasos.

  1. Digestión de pL6eGFP utilizando la enzima BtgZI
    1. Digiera 1 μg de plásmido pL6eGFP35 con 1 μL de enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) durante 4 h a 60 °C en una mezcla de reacción de 20 μL, siguiendo el protocolo del fabricante de la enzima para las condiciones de reacción.
    2. Después del período de incubación de 4 horas, ejecute el plásmido digerido en un gel de agarosa al 1% y extraiga la pieza de gel (~ 9,8 kb) que contiene el plásmido digerido. Purifique el plásmido digerido utilizando un kit de extracción en gel basado en columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Recocido de oligonucleótidos
    1. Reconstituya los oligonucleótidos (Ck1GUIDEFWD y Ck1GUIDEREV) en agua libre de DNasa/RNasa para preparar una solución madre de 100 μM.
    2. Combine 20 μM de cada oligonucleótido en una solución que contenga 10 mM de Tris (pH 8,0), 50 mM de NaCl y 1 mM de EDTA. Incubar la mezcla a 95 °C en un baño seco durante 5 min y dejar que la reacción se enfríe a temperatura ambiente. Por lo general, se tarda 1 h para que la temperatura de la mezcla de reacción alcance la RT.
    3. Diluir los oligonucleótidos recocidos a 0,5 μM en Tris pH 8,0, lo que da como resultado un volumen total de mezcla de reacción de 100 μL.
  3. Reacción en fusión
    1. Combine 1,5 μL de oligonucleótidos diluidos con 100 ng de plásmido linealizado digerido por BtgZI en una premezcla de enzimas In-Fusion 5x en un volumen de reacción total de 10 μL para generar una guía CDPK1 que contenga plásmido pL6CK1G.
    2. Incubar la reacción durante 15 min a 50 °C. Almacene la reacción a 4 °C hasta que se proceda a la transformación de E. coli.
      NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, la mezcla de reacción se puede almacenar a -20 °C.
  4. Transformación de E. Coli Células estelares competentes
    1. Agregue 2,5 μL de la mezcla de reacción a la E. Coli Células competentes estelares y proceder con el proceso de transformación siguiendo el protocolo del fabricante.
    2. Coloque las células competentes transformadas en una placa de ampicilina LB (100 μg/mL) y permita que las bacterias transformadas crezcan a 37 °C durante la noche.
    3. Seleccione las colonias transformadas y extraiga el plásmido utilizando un kit de minipreparación de plásmidos disponible en el mercado. Siga las instrucciones del fabricante para la purificación de plásmidos. Validar la inserción de la guía en el plásmido mediante secuenciación de ADN de Sanger.

7. Clonación del brazo de homología para la reparación del locus cdpk1 restringido a la endonucleasa Cas9

NOTA: Se sintetiza comercialmente un brazo de homología que comprende los SNP que se introducirán en el locus objetivo. Por lo general, tomamos un brazo de homología de 400-1000 pb de longitud. El brazo de homología contiene mutaciones silenciosas en la región del ARN guía y PAM para evitar el recorte del locus modificado después de la incorporación de los SNP deseados. El brazo de homología (correspondiente a los nucleótidos 133 a 553 de CDPK1), que incorpora mutaciones Met o Ser gatekeeper y mutaciones silenciosas, está flanqueado por sitios de restricción AflII y SpeI.

  1. Digestión doble 1 μg de pL6CK1G y el plásmido que contiene el brazo de homología utilizando 0,5 μL de enzimas de restricción AflII (20.000 U/ml) y SpeI (20.000 U/ml) durante 4 h a 37 °C en una mezcla de reacción de 20 μL.
  2. Ejecute la reacción completa de plásmidos de doble digestión en gel de agarosa al 1,5 % y purifique las bandas correspondientes al brazo de homología y la columna vertebral del plásmido de pL6CK1 utilizando un kit de extracción en gel siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Ligue el brazo de homología digerido con 100 ng de plásmido pL6CK1 en una relación vector-inserto de 1:5 en un volumen total de reacción de 10 μL utilizando ADN ligasa T4. Incubar la reacción de ligadura durante la noche a 16 °C. Transforme las células competentes de E. coli DH5α con la mezcla de ligadura completa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Coloque las células transformadas en placas de agar LB que contengan ampicilina (100 μg/mL) para seleccionar transformantes positivos. Seleccione colonias individuales de la placa de ampicilina LB y purifique el plásmido utilizando un kit de extracción de plásmidos.
  5. Confirme el clon para la presencia del brazo de homología digiriendo el plásmido purificado con las enzimas AflII y SpeI utilizando la misma condición de digestión que se describe en el paso 7.3. Confirme aún más los clones positivos de doble digestión mediante la secuenciación de ADN de Sanger para validar la secuencia completa del brazo de homología.

8. Purificación de plásmidos pL6CK1Met, pL6CK1Ser y pUF1 para la transfección del parásito de la malaria

  1. Fije 5 mL de cultivos primarios de clones verificados por secuencia de pL6CK1Met, pL6CK1Ser y pUF1 en medios LB que contengan ampicilina (100 μg/mL) e incube durante 10 h. Transfiera el cultivo primario al cultivo secundario en una proporción de 1:1000 e incube durante 12 h adicionales.
  2. Granular el cultivo bacteriano por centrifugación a 5000 x g durante 10 min en una botella centrífuga.
  3. Aísle los plásmidos utilizando un kit de purificación de plásmidos de acuerdo con el protocolo del fabricante. Disuelva el ADN plasmídico en agua libre de ADNasa/RNasa para la transfección directa del parásito.

9. Cultivo in vitro de Plasmodium falciparum y sincronización de sorbitol para la transfección

NOTA: El cultivo in vitro de P. falciparum en glóbulos rojos humanos (RBC) se realiza de acuerdo con el método descrito por Trager y Jensen36.

  1. Propagar la cepa NF54 de P. falciparum mediante cultivo en glóbulos rojos humanos O+ a un hematocrito del 2% en medio RPMI completo (cRPMI) que contenía RPMI 1640 suplementado con L-glutamina, 25 mM de HEPES, 25 mM de bicarbonato de sodio y 50 μg/mL de hipoxantina. Complementar el medio con AlbuMAX II al 0,5 % y gentamicina al 10 μg/mL y mantener el cultivo a 37 °C en una atmósfera de 5 % deO2, 5 % de CO2 y 90 % de N2.
  2. Para la sincronización del sorbitol para obtener el parásito en etapa anular, granule los parásitos asíncronos en un tubo cónico de 50 mL por centrifugación a 2.300 x g durante 3 min en RT. Deseche el sobrenadante.
  3. Incubar los glóbulos rojos parasitados con 9 volúmenes de sorbitol al 5% durante 10 min a 37 °C. Después de la incubación, granule los glóbulos rojos por centrifugación a 2.300 x g durante 3 minutos y deseche el sorbitol.
  4. Lavar los parásitos tratados con sorbitol con RPMI incompleto, iRPMI (medios RPMI sin albúmala y bicarbonato de sodio) y posteriormente incubarlos en cRPMI. Utilice los parásitos en etapa de anillo en el siguiente ciclo para la transfección de plásmidos.

10. Transfección de parásitos en estadio anular con plásmidos pL6CK1Met, pL6CK1Ser y pUF1

NOTA: Los siguientes pasos se emplean para la transfección directa de parásitos en etapa de anillo con ADN plasmídico.

  1. Prepare 2x tampón cytomix37 disolviendo en 30 mL de agua, 240 mM de KCl, 0,3 mM de CaCl2, 4 mM de EGTA, 10 mM de MgCl2, 20 mM de K2HPO4/KH2PO4 y 50 mM de HEPES. Ajusta el pH a 7,6. Ajuste el volumen final a 50 mL. Filtro: esterilice el tampón con un filtro de jeringa de 0,22 μm. A continuación, diluya el tampón cytomix 2x con agua estéril para obtener un tampón cytomix 1x.
  2. En un tubo cónico estéril de 15 mL, agregue 100 μL de glóbulos rojos parasitados empaquetados en etapa anular y lávelos 2 veces con 5 mL de tampón cytomix 1x. Realizar los lavados por centrifugación a 994 x g durante 3 min a RT.
  3. Después del lavado, retire el tampón y agregue 50 μg de cada plásmido (pL6CK1Met/pUF1 para generar la mutación T145M y pL6CK1Ser/pUF1 para generar la mutación T145S) en los glóbulos rojos parasitados empaquetados. Luego, agregue 2x tampón de acuerdo con el volumen de plásmido y ajuste el volumen a 400 μL con una concentración de tampón 1x.
  4. Transfiera 400 μL de la solución anterior a cubetas de 0,2 cm para cada transfección. Electroporar utilizando las siguientes condiciones: 0,31 kV, 950 μF y resistencia establecida en Infinito.
  5. Después de la electroporación, retire los parásitos transfectados de la cubeta, mézclelos con cRPMI y transfiéralos a un matraz T25 con un volumen total de 15 mL. Incubar los parásitos durante 2 h en las condiciones mencionadas en el paso 9.1.
  6. Después de la incubación, transfiera los parásitos transfectados a un tubo cónico de 50 mL y centrifugue a 994 x g durante 3 min. Retirar el sobrenadante y lavar los parásitos con 10 mL de RPMI incompleto. Cultivarlos con cRPMI fresco durante 2 días, reponiendo el medio de cultivo después de 24 h.
  7. Después de 48 h, retire el cRPMI de cada matraz y vuelva a suspender el cultivo en cRPMI que contenga 2 nM de WR99210 y 150 nM de DSM26738. A continuación, transfiera el cultivo a un matraz T75 añadiendo 400 μL de glóbulos rojos frescos. Reponga el medio diariamente con cRPMI que contenga WR99210 y DSM267 durante 7 días. Posteriormente, agregue cRPMI que contenga ambos medicamentos cada dos días hasta el día 14 después de la transfección.
  8. El día 14, alícuota 200 μL de cultivo transfectado en un tubo de microcentrífuga (MCT) de 1,5 mL para la preparación de portaobjetos. Granular las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante y transferir las células al portaobjetos. Haz una mancha con otra diapositiva colocándola en un ángulo de 45°.
  9. Fije el portaobjetos en metanol y prepare la tinción de Giemsa diluyéndola 1:10 en agua ultrapura. A continuación, tiñe el portaobjetos sumergiéndolo completamente en el tinte Giemsa durante 20 min. Lave el portaobjetos con agua corriente y séquelo bien. Luego, observe el portaobjetos bajo un microscopio óptico con un aumento de 100x aplicando aceite de inmersión.
  10. Una vez que se visualicen los parásitos, reponga los medios diariamente y déjelos crecer durante 2-3 días. A continuación, elimine los parásitos para verificar la modificación deseada en la secuencia del gen objetivo en el locus objetivo.
    NOTA: Si los parásitos no son visibles el día 14, reponga el medio (que contiene ambos medicamentos) después de 4 días. Cortar el parásito en un 30% y añadir sangre fresca para mantener un 2% de hematocrito cada 7 días hasta que los parásitos vuelvan a aparecer.

11. Verificación por PCR de parásito transgénico con la modificación deseada del locus cdpk1

  1. Después de 2-3 días de crecimiento del parásito, extraiga 500 μL de cultivo y transfiéralo a un MCT de 1,5 mL.
  2. Granular las células por centrifugación a 2.400 x g durante 5 min. A continuación, lisar los glóbulos rojos mediante tratamiento con saponinas.
    1. Para el tratamiento con saponinas, añadir 10 μL de solución de saponina al 10% a 1 mL de pellet de parásito resuspendido y mantener a 4 °C durante 5 min. Centrifugar las células a 2.400 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Repita este paso hasta que el enrojecimiento desaparezca por completo y se obtenga una bolita de parásitos de color negro.
  3. Lave el pellet de parásitos con 1 mL de 1x PBS por centrifugación a 2.400 x g durante 5 min. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 50 μL de agua libre de DNasa/RNasa. Calentar el pellet de parásito resuspendido a 95 °C durante 5 min, seguido de una centrifugación a 16.200 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN del parásito a un tubo nuevo.
  4. Utilice el material genético anterior para amplificar por PCR el gen de longitud completa empleando el conjunto de cebadores ck1f1 y ck1r3wt (consulte la Tabla 1), dirigiéndose específicamente a la región fuera del brazo de homología como se describe anteriormente en el paso 1.2. Secuencia la región de homología que contiene la mutación T145M utilizando el cebador ck1f1 .

12. Limitación de la dilución para la obtención de parásitos transgénicos clonales

  1. Después de la verificación de la secuencia, diluir el cultivo de parásitos transfectado para lograr una concentración final de 1 parásito por 200 μL. A continuación, añada 100 μL del cultivo diluido a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Realice los siguientes pasos (12.2-12.4) para lograr 1 parásito/200 μL.
  2. Prepare 10 mL de glóbulos rojos parasitados con 2% de hematocrito. Estimar el porcentaje de parasitemia del cultivo utilizando el método de tinción de Giemsa descrito anteriormente. Luego, cuente el número total de glóbulos rojos en un cultivo diluido 1:100 con un hemocitómetro.
    Número total de glóbulos rojos/ml = Número promedio de glóbulos rojos contados x Factor de dilución x 104
    Número de glóbulos rojos parasitados/ml = (porcentaje de parasitemia x número total de glóbulos rojos/ml)/100
  3. Prepare una dilución 1:10.000 de glóbulos rojos parasitados diluyendo en serie el cultivo inicial 2 veces (dilución 1:100 cada uno).
  4. Añadir un volumen adecuado (en microlitros) del cultivo diluido para conseguir un total de 50 parásitos en 10 mL de medio, asegurando un 2% de hematocrito. A continuación, añada 100 μL del medio que contiene 50 parásitos a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Coloque la placa en un secador hermético enjuagado con gas mezclado (composición como se describe anteriormente en el paso 9.1) e incube a 37 °C. Reemplace el medio después de cada 2 días.
  5. Reemplace el medio con cRPMI que contenga un 2% de hematocrito cada 7días hasta que aparezcan los parásitos.
    1. Incline la placa de 96 pocillos a un ángulo de 45° y permita que los glóbulos rojos se asienten. Con una pipeta serológica, retire con cuidado el medio de cada pocillo y observe un cambio de color a amarillo en los pocillos que contienen parásitos, en contraste con el color rosado del medio en los pocillos libres de parásitos. Este cambio de color se produce porque los parásitos acidifican el medio.
  6. Después de observar el cambio de color, saque una pequeña cantidad de cultivo del pocillo que exhibe el cambio de color y prepare un frotis en un portaobjetos, etiquetándolo con un número correspondiente a la posición del pocillo. Tiña el portaobjetos con tinción de Giemsa y obsérvalo bajo un microscopio como se ha descrito anteriormente.
  7. Transfiera el contenido del pocillo a un matraz T25 donde se observaron parásitos bajo el microscopio. Deje que los parásitos crezcan en el matraz T25 durante 4-5 días y reponga el medio cada dos días.
  8. Una vez que la parasitemia alcance el 2-3%, extraiga 500 μL de cultivo de parásitos. A continuación, se realiza un lisis de saponina de los glóbulos rojos y se procede a extraer el material genético del parásito utilizando el método descrito en la sección 11.
  9. Para confirmar la generación de parásitos transgénicos clonales, configure una reacción de PCR como se describe anteriormente en el paso 1.1.1 y envíe el producto de PCR para la secuenciación del ADN para confirmar la introducción de los SNP deseados en el locus objetivo.

13. Análisis de transcripciones mediante PCR en tiempo real

  1. Purificación y sincronización de los parásitos por Percoll/Sorbitol
    1. Prepare un gradiente de Percoll/Sorbitol39,40 superponiendo secuencialmente 3 mL de 70% cada uno seguido de soluciones de percoll/sorbitol al 40% en un tubo cónico de 15 mL.
    2. Aplique suavemente capas de 1-2 mL de cultivo de parásitos que contengan predominantemente el parásito en etapa esquizonta de WT y CDPK1 T145M en la parte superior del gradiente.
    3. Centrifugar el gradiente a 2.300 x g durante 15 min en RT utilizando la desaceleración establecida en 4 en centrífuga en un rotor de cangilón oscilante.
    4. Recoja el anillo central que contiene las etapas de trofozoíto y esquizonte del parásito de la interfaz del gradiente en un tubo cónico fresco de 50 mL.
    5. Lave los parásitos agregando un volumen igual de 9:1 (cRPMI: 10xPBS), luego centrifugue a 994 x g durante 3 min para granular los parásitos.
    6. Lavar el pellet de nuevo con una solución de 19:1 (cRPMI:10xPBS), luego centrifugar a 994 x g durante 3 min.
    7. Añada cada pellet de parásito a matraces separados que contengan cRPMI con un 2% de hematocrito (preincubado a 37 °C). Incubar los matraces durante 4 h en las condiciones descritas anteriormente en el paso 9.1 para permitir la invasión de los merozoítos de los esquizontes enriquecidos en eritrocitos frescos.
    8. Después de 4 h, trate los parásitos con sorbitol como se describe anteriormente en los pasos 9.2-9.4 para obtener parásitos en etapa anillo altamente sincronizados de 0 a 4 h.
    9. Incubar los parásitos sincronizados durante 44 h después del tratamiento con sorbitol para obtener la etapa de schizont de 44 a 48 h del parásito.
  2. Aislamiento de ARN de esquizontes de parásitos WT y CDPK1 T145M
    1. Cosechar los parásitos WT y CDPK1 T145M a las 44-48 h post-invasión. Lave los gránulos de parásitos con 1x PBS a 994 x g durante 5 min a 4 °C.
    2. Vuelva a suspender los gránulos de parásito en 1 mL de 1x PBS y trátelos con saponina para lisar los glóbulos rojos circundantes como se describe en el paso 11.2.1.
    3. Vuelva a suspender el pellet de parásito en 1 mL de reactivo de extracción de ARN y almacene a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
    4. Descongele el pellet congelado a 15-30 °C para la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.
    5. Añadir 200 μL de cloroformo por mL de reactivo de extracción de ARN y agitar los tubos enérgicamente con la mano durante 15 s. Incubar en RT durante 2-3 min.
    6. Centrifugar la mezcla a 16.200 x g durante 15 min a 4 °C. El ARN permanecerá exclusivamente en la capa acuosa superior incolora. Aísle el ARN usando un kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Síntesis de ADNc a partir del ARN del parásito WT y CDPK1 T145M
    1. Trate las muestras que contienen ARN con un kit de extracción de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminar el ADN contaminante.
    2. Sintetice ADNc a partir de las muestras de ARN aisladas utilizando un kit de síntesis de ADNc de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilizamos cebadores de hexámeros aleatorios para el proceso de transcripción inversa en lugar de cebadores de oligo-dT.
    3. Asegúrese de que los controles de NO-RT (reacciones configuradas sin agregar la enzima transcriptasa inversa) para cada muestra de ARN utilizada para la preparación de ADNc excluyan el arrastre de contaminación de ADN genómico del ARN purificado durante la preparación del ADNc.
    4. Analice el ADNc amplificando cualquier segmento de gen que contenga una secuencia intrónica intermedia, como el gen cdpk1 de longitud completa, para descartar la contaminación genómica del ADN. Utilice la condición de PCR como se describe en el paso 1.1.1.
  4. Análisis de la expresión de transcripción del parásito WT y CDPK1 T145M
    1. Utilice el ADNc preparado a partir de los parásitos WT y CDPK1 T145M para realizar análisis de expresión de transcripción de 11 genes diferentes a través de PCR en tiempo real. Los 11 genes diana incluyen 7 miembros de la familia CDPK y 4 quinasas implicadas en la invasión de los glóbulos rojos (véase la Tabla 2 para los genes y los cebadores correspondientes utilizados para la PCR en tiempo real).
    2. Diseñe cebadores utilizando software de síntesis de cebadores. Amplifique aproximadamente 120 pb de cada gen seleccionado utilizando cebadores específicos de genes con temperaturas de fusión similares.
    3. Amplifique los genes objetivo mediante una premezcla y ejecute la placa en un sistema de PCR en tiempo real utilizando los siguientes parámetros de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido a 52 °C durante 20 s y extensión a 62 °C durante 30 s.
    4. Normalizar el nivel de expresión de cada gen utilizando dos genes de mantenimiento, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y la treonina tRNA ligasa (ThrRS)32. Calcule la expresión relativa de cada quinasa diana en el parásito CDPK1 T145M en comparación con el control WT.
    5. Realice el análisis estadístico utilizando el paquete de análisis estadístico R. Alternativamente, utilice cualquier otro software de análisis.
      NOTA: Los métodos de transcriptómica global, como RNA-Seq o microarray, son enfoques superiores para obtener una visión más amplia del recableado del transcriptoma en parásitos mutantes en comparación con WT.

Resultados

La WT CDPK1 recombinante se expresa como una proteína de fusión con una etiqueta N-terminal de glutatión S-transferasa (GST) y se purifica mediante cromatografía de afinidad GST. La proteína CDPK1 purificada se detectó a través de Western blot utilizando anticuerpos anti-CDPK1 y anti-GST (Figura 1). El residuo guardián de la treonina (T145) en WT CDPK1 se reemplazó con Met y Ser utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar proteínas recom...

Discusión

La generación de un parásito transgénico mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 se basa en los datos de actividad de quinasas in vitro con enzimas recombinantes. Es mejor generar tantas proteínas recombinantes mutantes con diferentes residuos de control como sea posible. Dado que el genoma de P. falciparum es altamente rico en AT, por lo tanto, la expresión de proteínas recombinantes en E. coli puede requerir optimización d...

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo y las instalaciones disponibles a través de la Instalación Central de Instrumentación de la Facultad de Ciencias de la Vida, JNU. También se agradece el apoyo financiero del Departamento de Biotecnología (BT/PR28256/MED/29/1313/2018) a AB. Agradecemos a Jose-Juan Lopez-Rubio por proporcionar plásmidos pL6eGFP y pUF1. La agencia financiadora no tiene ningún papel en la preparación y decisión de publicar el trabajo. MS es beneficiaria de la beca JRF-SRF del Consejo de Investigación Científica e Industrial.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1x phosphate inhibitor cocktailSigma-Aldrich04906 845001
AflIINEBR0520S
Albumax II Gibco11021-037
Anti-GST antibodyThermoFisher ScientificG7781
Anti-Mouse HRPSigma-AldrichA4416
Anti-Rabbit HRPSigma-AldrichA6154
BamHINEBR3136S
BtgZ1NEBR0703S
CentrifugeThermoFisher ScientificSorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)ThermoFisher ScientificSorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnINEBRO1765
D-Sorbitol Sigma-AldrichS1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cellsSigma-Aldrich69956
E. coli DH5a Competent CellsTakara Bio9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gapBioRad1652086
ElectroporatorBioRadGenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagentG-Bioscience7860-003
GentamicinThermoFisher Scientific15750078
Giemsa StainHimediaS011-100ML
Glutathione Sepharose 4BGE Healthcare17075601
HEPES, Free AcidMerck391338
HypoxanthineMerck4010CBC
In-fusion HD cloning KitTakara Bio1711641A
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708880EDU
MBP, dephosphorylated Merck13-110
NotINEBR3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF  Takara Bio740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kitTakara Bio740609
PercollGE Healthcare17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)AbcamAb138910
Primestar Max DNA PolymeraseTakara BioR045A
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit Qiagen27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kitAgilent200521
RNeasy Mini kitQiagen74104
RPMI-1640ThermoFisher Scientific31800-105
SaponinSigma-Aldrich47036
Sodium BicarbonateSigma-AldrichS5761
SpeI-HFNEBR3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kitThermoFisher Scientific18080-051
T4 DNA LigaseThermoFisher Scientific15224017
Thiophosphate ester antibodyAbcamAb92570

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