Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

Resumen

El sistema ocular de Drosophila es una herramienta útil para estudiar diversos procesos biológicos, en particular las enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, la cuantificación manual de los fenotipos de ojos ásperos puede ser sesgada y poco fiable. Aquí describimos un método por el cual ilastik y Flynotyper se utilizan para cuantificar el fenotipo del ojo de una manera imparcial.

Resumen

El ojo compuesto de Drosophila melanogaster es una gama bien estructurada y completa de alrededor de 800 omatidios, que exhiben un patrón simétrico y hexagonal. Esta regularidad y facilidad de observación hacen del sistema ocular de Drosophila una poderosa herramienta para modelar diversas enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, las formas de cuantificar los fenotipos anormales, como la clasificación manual de las puntuaciones de gravedad ocular, tienen limitaciones, especialmente cuando se clasifican las alteraciones débiles en la morfología del ojo. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques computacionales como Flynotyper. El uso de un anillo de luz permite obtener mejores imágenes cualitativas accediendo a la integridad de los omatidios individuales. Sin embargo, estas imágenes no pueden ser analizadas por Flynotyper directamente debido a las sombras en los omatidios introducidas por el anillo de luz. Aquí, describimos una forma imparcial de cuantificar los fenotipos de ojos ásperos observados en modelos de enfermedad de Drosophila mediante la combinación de dos software, ilastik y Flynotyper. Al preprocesar las imágenes con ilastik, se puede lograr una cuantificación exitosa del fenotipo del ojo rugoso con Flynotyper.

Introducción

El genoma de Drosophila melanogaster contiene ~75% de ortólogos genéticos relacionados con enfermedades humanas. Además, durante el desarrollo del ojo de Drosophila, se expresan aproximadamente dos tercios de los genes del genoma, lo que convierte al ojo de Drosophila en un sistema genético excepcional para investigar diversas funciones moleculares y celulares, desarrollo y modelos de enfermedades ^1,2. Por lo tanto, el sistema ocular de Drosophila es una herramienta experimental útil para estudiar diversos procesos biológicos.

Protocolo

1. Preparación para la cuantificación

1. Descargue e instale ilastik¹¹, ImageJ y el complemento ImageJ Flynotyper¹. Consulte la Tabla de materiales para ver los enlaces del sitio web a la instalación. Descargue los paquetes apropiados de acuerdo con el sistema operativo de la computadora (Mac, Windows, Linux, etc). Siga las instrucciones de instalación exactamente como se indica.
   NOTA: Es imperativo seguir las instrucciones exactamente como se indica en los enlaces proporcionados. La computadora utilizada necesita un sistema operativo de 64 bit....

Resultados

En un estudio previo, utilizamos este protocolo para determinar modificadores genéticos de la proteína VCP mutante relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica con demencia frontotemporal (ELA-FTD)¹². Además, este método también se utilizó en otro artículo para evaluar la toxicidad de CHCHD10 ALS-FTD mediada por^S59L, incluso cuando se utilizó un microscopio estereoscópico más antiguo¹³. Para validar aún más esto.......

Discusión

Los omatidios de Drosophila constituyen un sistema útil para el estudio de diversas funciones biológicas y enfermedades genéticas. La regularidad de los omatidios es una buena medida para examinar el efecto de las mutaciones genéticas⁴. Aunque existen varios métodos para calcular la regularidad omatidial, como la clasificación manual, estos métodos pueden estar muy sesgados. Para superar este enfoque sesgado, se han desarrollado herramientas semiau.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.