Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

Resumen

El sistema ocular de Drosophila es una herramienta útil para estudiar diversos procesos biológicos, en particular las enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, la cuantificación manual de los fenotipos de ojos ásperos puede ser sesgada y poco fiable. Aquí describimos un método por el cual ilastik y Flynotyper se utilizan para cuantificar el fenotipo del ojo de una manera imparcial.

Resumen

El ojo compuesto de Drosophila melanogaster es una gama bien estructurada y completa de alrededor de 800 omatidios, que exhiben un patrón simétrico y hexagonal. Esta regularidad y facilidad de observación hacen del sistema ocular de Drosophila una poderosa herramienta para modelar diversas enfermedades neurodegenerativas humanas. Sin embargo, las formas de cuantificar los fenotipos anormales, como la clasificación manual de las puntuaciones de gravedad ocular, tienen limitaciones, especialmente cuando se clasifican las alteraciones débiles en la morfología del ojo. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques computacionales como Flynotyper. El uso de un anillo de luz permite obtener mejores imágenes cualitativas accediendo a la integridad de los omatidios individuales. Sin embargo, estas imágenes no pueden ser analizadas por Flynotyper directamente debido a las sombras en los omatidios introducidas por el anillo de luz. Aquí, describimos una forma imparcial de cuantificar los fenotipos de ojos ásperos observados en modelos de enfermedad de Drosophila mediante la combinación de dos software, ilastik y Flynotyper. Al preprocesar las imágenes con ilastik, se puede lograr una cuantificación exitosa del fenotipo del ojo rugoso con Flynotyper.

Introducción

El genoma de Drosophila melanogaster contiene ~75% de ortólogos genéticos relacionados con enfermedades humanas. Además, durante el desarrollo del ojo de Drosophila, se expresan aproximadamente dos tercios de los genes del genoma, lo que convierte al ojo de Drosophila en un sistema genético excepcional para investigar diversas funciones moleculares y celulares, desarrollo y modelos de enfermedades ^1,2. Por lo tanto, el sistema ocular de Drosophila es una herramienta experimental útil para estudiar diversos procesos biológicos.

El ojo compuesto de Drosophila es una matriz bien estructurada y completa de ~ 800 omatidios que exhiben un patrón simétrico y hexagonal³. La regularidad de este patrón hexagonal se puede utilizar para estimar el efecto de la introducción de mutaciones y cambios en la expresión génica en la morfología del ojo⁴. Los estudios previos que requieren la evaluación de la morfología del ojo se han basado en gran medida en la clasificación manual de la gravedad de los fenotipos del ojo detectados a simple vista. Para clasificar los fenotipos oculares, las imágenes de la morfología externa del ojo se toman con un microscopio estereoscópico ^5,6. El fenotipo ocular de cada grupo se evalúa dividiendo el ojo externo en cuatro áreas y calculando la proporción de degeneración en cada área ^5,6. A continuación, los valores se utilizan para calcular promedios que se comparan con los valores obtenidos de las moscas de control⁷. La puntuación se basa en el grado de fusión, la pérdida de omatidios y la organización de las cerdas ^7,8. Las fotos de ojo de mosca tomadas con un microscopio estereoscópico son adquiridas por un investigador, y el análisis del fenotipo del ojo es realizado por otro investigador con conjuntos de triple validación ^7,8.

A simple vista se trata de clasificar las alteraciones débiles en la morfología del ojo, existen limitaciones⁴. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado enfoques computacionales como FLEYE y Flynotyper ^1,9. Flynotyper es un nuevo método computacional para estimar cuantitativamente los cambios morfológicos en el sistema ocular de Drosophila¹. Detecta automáticamente el ojo de Drosophila y el omatridio individual, calculando las puntuaciones fenotípicas (puntuaciones P) en función de la irregularidad delojo¹. Una puntuación P más alta indica que el ojo de la mosca está más degenerado. Este software se utilizó con éxito para cuantificar la anormalidad de los ojos de Drosophila ¹⁰. Aunque Flynotyper garantiza un proceso automatizado, todavía no se puede aplicar con éxito a algunas imágenes oculares tomadas por varios métodos de microscopía óptica.

Cualitativamente, preferimos una fuente de luz anular en comparación con una fuente de luz de un solo punto, ya que ofrece una representación más precisa de cada omatidio. Sin embargo, cuando se utiliza el anillo de luz, genera una sombra en forma de anillo en la parte superior de cada omatidio debido a la forma semiesférica del omatidio. Esta sombra en forma de anillo inhibe la detección omatidial precisa por parte de Flynotyper, lo que lleva a un cálculo incorrecto de las puntuaciones P.

Para superar estos problemas, implementamos ilastik, una herramienta basada en el aprendizaje automático para varios análisis, para clasificar omatidios en imágenes de ojo de mosca¹¹. A continuación, introducimos las imágenes generadas por ilastik en Flynotyper para calcular las puntuaciones P. Esto nos permite cuantificar los defectos morfológicos del ojo de Drosophila de forma imparcial¹.

Protocolo

1. Preparación para la cuantificación

1. Descargue e instale ilastik¹¹, ImageJ y el complemento ImageJ Flynotyper¹. Consulte la Tabla de materiales para ver los enlaces del sitio web a la instalación. Descargue los paquetes apropiados de acuerdo con el sistema operativo de la computadora (Mac, Windows, Linux, etc). Siga las instrucciones de instalación exactamente como se indica.
   NOTA: Es imperativo seguir las instrucciones exactamente como se indica en los enlaces proporcionados. La computadora utilizada necesita un sistema operativo de 64 bits; de lo contrario, no se requieren otras especificaciones. Consulte la Tabla de materiales para conocer las especificaciones informáticas del sistema utilizado para este protocolo.
2. Use una imagen estándar para entrenar el modelo de aprendizaje automático. Tome una imagen de un ojo de mosca sano usando un microscopio óptico con un anillo de luz (como w1118 x GMR-GAL4), usando el centro del ojo como punto focal. Analice a los hombres y a las mujeres por separado; Por lo tanto, adquiera una imagen estándar para hombres y para mujeres.
   NOTA: Los ajustes variarán ampliamente según el microscopio y la cámara. Consulte el segundo párrafo de la discusión para obtener información más general sobre la preparación de moscas y la adquisición de imágenes.
3. Tome imágenes de los ojos de mosca experimentales utilizando la misma configuración utilizada para la adquisición de imágenes estándar.
   NOTA: Una buena orientación es primordial para una cuantificación precisa. Consulte la Figura 4 como ejemplo para obtener una orientación adecuada.

2. Uso de ilastik para detectar omatidios a partir de imágenes de ojo de mosca

1. Antes de comenzar el análisis, asegúrese de que todos los grupos experimentales, independientemente de la condición experimental, estén en la misma carpeta de archivos para facilitar los siguientes procesos. Asegúrese de que los archivos tengan un nombre adecuado para identificar grupos experimentales y distinguir entre machos y hembras.
   NOTA: Recomendamos imprimir el protocolo y usar la computadora para acercar las figuras, ya que este protocolo se sigue visualmente más fácilmente.
2. Abra el software.
   NOTA: Se recomienda no tener otras aplicaciones abiertas mientras se ejecuta el software; De lo contrario, el equipo podría funcionar muy lentamente, especialmente en sistemas más antiguos o menos robustos.
3. Haga clic en Crear nuevo proyecto | Otros flujos de trabajo, elija Recuento de densidad de celdas y seleccione una ubicación para guardar el archivo de proyecto (Figura 1A).
4. Haga clic en 1. Datos de entrada | Agregar nuevo | Agregue imágenes separadas. Elija la imagen estándar (Figura 1B).
5. Haga clic en 2. Selección de características y selección de características para usar. Seleccione las características que se muestran en la Figura 1C; Elija más valores Sigma para aumentar la sensibilidad (es decir, 10, 15, 20, etc.).
   NOTA: Si se marcan demasiadas casillas, es posible que el programa se ejecute durante mucho tiempo.
6. Haga clic en 3. Contando y establezca el valor sigma de primer plano en 5,00. Marque 50 o más omatridios individuales con la herramienta Primer plano en la imagen estándar.
   NOTA: Cincuenta marcas suelen ser adecuadas para el análisis; sin embargo, cuanto más omatidios estén marcados, más precisos serán los resultados (Figura 1D).
7. Haga clic en 3. Conteo y use la herramienta Fondo para marcar el exterior de los omatidios (Figura 1E). Dibuja líneas verdes en forma de celosía alrededor de los omatidios.
   NOTA: Al igual que con más marcas en los omatidios, cuantas más líneas verdes se dibujen, más precisos serán los resultados.
8. Haga clic en 4. Exportación de densidad | Elija Export Image Settings (Exportar configuración de imagen ) para establecer la configuración de la imagen (Figura 1F). Haga clic en Información del archivo de salida | seleccione Formato y tif para un análisis más detallado en Flynotyper.
9. Haga clic en 5. Procesamiento por lotes | Seleccione Archivos de datos sin procesar y seleccione todas las fotos de moscas experimentales que se analizarán (Figura 1G). La lista de imágenes importadas que se van a analizar se ve en Seleccionar archivos de datos sin procesar (Figura 1H). Haga clic en Procesar todos los archivos en la parte inferior de la 5. Sección de Procesamiento de Lotes .
   NOTA: Como recordatorio, los análisis masculinos y femeninos deben realizarse por separado. Dependiendo del equipo utilizado, este paso puede tardar 10 minutos o más, especialmente si hay muchas imágenes importadas.
10. Una vez finalizado el software, compruebe la misma carpeta de archivos que contiene las imágenes experimentales de ojo de mosca; habrá imágenes negras denominadas "YourSampleName_Probabilities" (Figura 1I).

3. Usar ImageJ para preparar fotos para Flynotyper

1. Abra el archivo .tif generado por ilastik (las cajas negras) en ImageJ.
   NOTA: Cada archivo de .tif generado por ilastik debe manejarse por separado.
2. Utilice la herramienta Selección de rectángulo para crear un rectángulo alrededor solo del ojo. Una vez que se haya dibujado el rectángulo, recorte el área eligiendo Ctrl + X o Ctrl + C (Figura 2A). Espera a que aparezca un cuadro negro con la forma del contorno del rectángulo.
   NOTA: El sistema operativo de la computadora determinará si usar 'Ctrl + X' o 'Ctrl + C'. Por lo general, 'Ctrl + X' es para Windows y 'Ctrl + C' se usa para Mac.
3. Abra el ojo de mosca ahora cortado con ImageJ; haga clic en Archivo | Nuevo | Portapapeles interno (Figura 2B).
4. Guarde el ojo de mosca cortado como JPEG haciendo clic en Archivo | Guardar como | JPEG. Las imágenes cortadas están ahora en la misma carpeta de archivos que las imágenes experimentales originales.
   NOTA: Para facilitar el siguiente paso, se recomienda crear una nueva carpeta de archivos llamada 'cortar' y colocar todas las imágenes cortadas en esa carpeta.

4. Uso de Flynotyper para calcular las puntuaciones fenotípicas

1. Abra Flynotyper como un complemento de ImageJ haciendo clic en Complementos | Flynotyper.
2. Seleccione Agregar genotipos y abra la carpeta que contiene las imágenes de ojo de mosca cortadas (carpeta de archivos de corte). El nombre de la carpeta aparecerá en Genotipos (Figura 2C).
3. Marque las casillas Microscopio óptico y Verticalmente, pero ajústelo en consecuencia si es necesario. Marque las casillas Estabilidad y Distancia al centro en Clasificar omatidios por: (Figura 2C).
4. En Número de omatidios clasificados considerados, ingrese 200.
   NOTA: En general, 200 es un buen número, pero ajústelo según sus preferencias.
5. Haga clic en Ejecutar y espere a que aparezcan los resultados del análisis (Figura 2D).
   NOTA: Este paso puede tardar 5 minutos o más (o menos) dependiendo de la potencia de procesamiento de la computadora utilizada.
6. Copie y pegue el archivo de muestra y la puntuación P en el software estadístico para su posterior análisis.

Resultados

En un estudio previo, utilizamos este protocolo para determinar modificadores genéticos de la proteína VCP mutante relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica con demencia frontotemporal (ELA-FTD)¹². Además, este método también se utilizó en otro artículo para evaluar la toxicidad de CHCHD10 ALS-FTD mediada por^S59L, incluso cuando se utilizó un microscopio estereoscópico más antiguo¹³. Para validar aún más esto...

Discusión

Los omatidios de Drosophila constituyen un sistema útil para el estudio de diversas funciones biológicas y enfermedades genéticas. La regularidad de los omatidios es una buena medida para examinar el efecto de las mutaciones genéticas⁴. Aunque existen varios métodos para calcular la regularidad omatidial, como la clasificación manual, estos métodos pueden estar muy sesgados. Para superar este enfoque sesgado, se han desarrollado herramientas semiau...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.