Preparación de balas de cañón de genes y transfección biolística de neuronas en cultivo Cortar

Resumen

Se describe un método para la preparación de las balas recubiertas de oro de ADN y demostrar el uso de balas como para transfectar biolistically neuronas en cultivos de rodajas de hipocampo.

Resumen

Transfección biolística es un medio físico de la transfección de células de los tejidos mediante el bombardeo con partículas de alta velocidad de ADN recubierto. Ofrecemos un protocolo detallado para la transfección biolística de rodajas de hipocampo de rata, desde la preparación inicial de las balas recubiertas de ADN con el tiroteo final de las culturas rebanada organotípicos con una pistola de genes. Transfección de genes arma es un medio eficiente y fácil de transfectar neuronas y es especialmente útil para el etiquetado fluorescente de un pequeño subconjunto de las células en el segmento del tejido. En este video, lo primero que describen los pasos necesarios para capa de partículas de oro con el ADN. A continuación se muestra cómo la línea interior de un tubo de plástico con las balas de oro / de ADN, y la forma de cortar este tubo para obtener los cartuchos de plástico para la carga en la pistola de genes. Finalmente, se realiza la transfección biolística de las culturas de ratas rebanada hipocampo, lo que demuestra el manejo de la Bio-Rad Helios pistola de genes, y ofrecer asesoramiento resolución de problemas para obtener cortes de tejido sano y transfectadas de manera óptima.

Protocolo

PROTOCOLO para la transfección biolística

Hacer balas

Las balas son buenas para un máximo de 6 meses, pero puede comenzar a disminuir en la eficiencia de la transfección después de 2-3 meses. Las balas deben ser almacenadas a 4 ° C en presencia de gránulos de desecante. Siempre que los viales de centelleo, en el que se almacenan las balas, la temperatura ambiente antes de abrir el vial.

Antes de empezar se han preparado:

• Espermidina (0,05 M)
• _CaCl2 (1M)
• EtOH (100%-de alto grado sin abrir la botella)
• Autoclave H ₂ 0
• De ADN que se transfectaron
• Polivinilpirrolidona (PVP-20 mg / ml)
• 2 X 15 mL cónico (2/bullet juego)
• Tubos (cortado en 1 X ~ 30 pulgadas / conjunto de bala)
• Centelleo viales (conjunto 1/bullet)
• Pellets de desecación
• 10 ml jeringa w / tubo en el extremo

Prepare la tubería:

1. Seca ~ 30 pulgadas de tubo (cerca de 2 pulgadas se extiende más allá del bien O-ring) en la estación de tubo w / N ₂ gas (0,4 de presión) por un mínimo de 20 min.

Precipitar el ADN de cuentas de oro:

1. Prepare de ADN que se transfectadas en un volumen de 50 μmL total en tubo de microcentrífuga (máximo 50 mg de ADN total)
2. Pesar de 6.8 mg de oro y la transferencia a un tubo de microcentrífuga
3. Añadir 100 ml de 0,05 M espermidina de oro y ultrasonidos durante 20 segundos
4. Agregue el l 50 de ADN para el oro / espermidina
5. Vortex (en torno al establecimiento de 5) w / tapa abierta
6. Añadir gota a gota 100 l de 1 M _de CaCl2
7. Tratar brevemente con ultrasonidos (<5 segundos)
8. Dejar decantar durante 10 minutos a temperatura ambiente
9. Tratar brevemente con ultrasonidos

Prepare una solución de PVP en ultrasonidos:

1. Haz una solución diluida de PVP en cónico de 15 ml, diluir 3.5mL PVP para cada conjunto de puntos (añadir 7,5 l de 20mg/ml acciones PVP a 3,5 ml EtOH al 100%)

Enjuague cuentas de oro con EtOH:

1. Decantar cuentas de oro a toda velocidad durante 10 segundos en microcentrífuga
2. Desechar el sobrenadante, pero mantener una pequeña cantidad de líquido en la parte superior de perlas de oro
3. Lave 3 veces con 1 ml de EtOH, tratar brevemente con ultrasonidos cada vez, si es necesario

Resuspender oro / ADN en la solución de PVP:

1. Resuspender el precipitado de oro en 200 l de los 3,5 ml diluida PVP / EtOH solución
2. Vortex la bolita de oro para volver a suspender (breve ultrasonidos, si es necesario)
3. Transferir el l 200 de oro / solución de PVP de un nuevo cono de 15 ml
4. Continúe de esta manera, la adición de 200 L de PVP en un momento hasta que todo el oro ha sido transferido a la forma cónica de 15 ml, y el volumen final es de 3,2 mL

Revestimiento de la tubería:

1. Apague el N ₂ en la estación de la tubería y remover el tubo seco
2. Conecte el tubo de secado a la jeringa de 10 ml
3. Agitar enérgicamente el cónico de 15 ml llena de oro / PVP
4. Coloque el extremo del tubo de oro / solución de PVP y aspirar lentamente con cuidado para evitar las burbujas
5. Deja ~ 2 pulgadas en seco de los dos extremos de la tubería
6. Con el tubo todavía unido a la jeringa y se llena con la solución de oro / PVP, se coloca cuidadosamente el tubo en la estación
7. Marcan el final del tubo donde se encuentra la solución
8. Deje que el oro reposar durante 5 minutos con la jeringa acoplada
9. Succión de la solución muy lentamente tirando de la jeringa para que el oro se establecieron se quede atrás (que no está seguro de hacer una copia de lavado)
10. Desconecte la jeringa
11. Girar 90 ° y deje reposar 2 segundos
12. Girar 180 ° y deje reposar de 2 segundos
13. Rotar el tubo durante 5 segundos
14. Encienda el N _{2, de} modo que la válvula se lee entre 0,4 a 0,5 y girar el tubo recubierto de oro durante el secado de 5 min.

Corte de la tubería:

1. Retire el tubo de la tubería de la estación de preparación y corte los extremos en las marcas.
2. Ponga un vial de centelleo etiquetados bajo el helicóptero tubo para coger los cartuchos de corte
3. Coloque los tubos en el helicóptero tubería y cortar el tubo con la navaja de limpieza
4. Coloque una pellets desecación en vial de centelleo
5. Almacene los cartuchos a 4 ° C

Disparos cortes de tejido

Al disparar rebanadas cultivadas, es importante emplear una técnica relativamente estéril, con el fin de evitar la contaminación. Recuerde, que al disparar dos construcciones diferentes, ambos conjuntos de balas se pueden cargar en el soporte del cartucho mismo, pero el barril-liner y la pantalla debe ser cambiado entre las construcciones.

Antes de empezar se han preparado:

• Balas de ADN (que vial de centelleo de la temperatura ambiente antes de la apertura)
• Cortes de tejido
• Helios pistola de genes
• Tanque de helio con una manguera de pistola de genes unidos
• Cartucho de titular
• Revestimiento de barril de plástico con junta tórica en su lugar
• Difusor (modificado)
• Difusor de pantalla
• Fórceps

Preparar la pistola de genes:

1. Utilizando unas pinzas colocar los cartuchos de oro recubiertas de plástico en el soporte del cartucho.
2. Coloque el soporte del cartucho en la pistola de genes, en primer lugar hacer retroceder bloqueo
3. Asegure el soporte del cartucho con el bloqueo
4. Obtener un revestimiento de cañón con una junta tórica y el difusor en su lugar
5. Atornille el barril-liner en la pistola de genes

Disparos rodajas cultivadas con la pistola de genes:

1. Póngase tapones para los oídos
2. Conecte la pistola de genes en la manguera conectada tanque de gas helio
3. A su vez la presión en el tanque de 180 PSI
4. Disparar a un blanco en el aire con el fin de eliminar el polvo y los escombros de la pantalla difusora. Para disparar el arma, primero presione el botón de bloqueo de seguridad hasta que suene el arma, luego apretar el gatillo.
5. Después de disparar el espacio en blanco, quitar los trozos de la incubadora
6. Avance arma para construir primero
7. Dispara con el difusor de 0,5 a 1 pulgada de la parte
8. Avanzar en el cartucho entre los pozos.
9. Después de disparar el último pozo, colocar las rodajas de nuevo en la incubadora
10. Apague la presión del gas y la liberación antes de desmontar la pistola de la manguera de helio
11. Desenroscar el barril de línea, y retire el cartucho y las conchas utilizadas

Limpieza de cartucheras y fundas barril:

1. Cartuchos de lugar, revestimientos barril, y las pantallas de difusor en un vaso con agua y jabón
2. Lugar vaso en baño de ultrasonido y sonicar durante 20 minutos
3. Lave con abundante agua hasta que todos los residuos de jabón se eliminan
4. Remoje en un 70% EtOH durante una hora
5. Colocar en una toalla de papel seca durante la noche para en seco
6. Limpiar los cartuchos, los revestimientos barril, y las pantallas se puede reutilizar en posteriores transfecciones biolística

Consejos de resolución de problemas para la transfección biolística

Transfección biolística a veces puede resultar en condiciones óptimas de transfección. Esto puede llevar a muy pocos o muy transfectadas muchas células, demasiado alta o demasiado baja los niveles de expresión, o pueden causar cortes de tejido para ser generalmente insalubres. A menudo, las rebanadas consecuencia malsana de la explosión de presión. Estos son algunos consejos para obtener de manera óptima transfectadas cortes de tejido.

Si los segmentos parecen ser poco saludables (o si demasiadas células son transfectadas / corte), trate de:

• aumentar la distancia de tiro
• disminuir la presión en el tanque de gas
• disminuir la cantidad de oro
• cortando el centro del difusor Bio-Rad y la sustitución del centro, con una pantalla difusora.

Si las células son muy pocos los transfectadas, trate de:

• disminuyendo la distancia de disparo
• aumento de la presión en el tanque de gas
• el aumento de la cantidad de oro
• aumentar el número de cortes de tejido / bien
• asegúrese de que la junta tórica en el barril-liner está intacto.

Si usted obtiene con las dos rebanadas de demasiadas células transfectadas y muy pocos en el rodaje mismo asegúrese de que:

• que usted está sosteniendo el arma sobre simétricamente bien
• que el oro es uniformemente recubrir el interior de la tubería. (Si usted está recibiendo una línea de oro, extraer el sobrenadante de la tubería a un ritmo más rápido una vez que el oro se ha asentado y gire el oro ya antes de encender el nitrógeno. Si, por el contrario, vas a encontrar vetas de oro , esto es probablemente debido a la exposición a un exceso de humedad durante la fabricación de bala: asegúrese de que está utilizando una botella sin abrir de EtOH, que el tubo esté completamente seco antes de pintar, y que las tapas de nivelación y preparación de las balas en el momento oportuno).

Si la eficiencia de transfección parece óptimo (# células transfectadas / corte), pero el nivel de expresión parece demasiado alto o demasiado bajo:

• ajustar el ADN relación al oro. (Por ejemplo, si es demasiado baja mantener la cantidad de oro, pero aumentar la cantidad de ADN.)
• ajustar la cantidad de tiempo entre la toma y recolección de datos

En el caso de la transfección doble, si usted está recibiendo muy poca expresión de uno de sus construcciones, ajustar la relación de las dos construcciones de la manera adecuada y asegúrese de que ambas construcciones se encuentran bajo el mismo promotor, a fin de asegurarse de que una promotor no fuera de competencia a la otra.

Discusión

Transfección biolística es un medio físico de la transfección de células a través de bombardeo de los tejidos vivos de alta velocidad de las partículas de oro recubiertas de ADN. En la transferencia de genes mediada por partículas, en general, las células transfectadas se producen cuando la bala se detiene en el núcleo. Mientras que muchos métodos de transfección existen diferentes, tales como la microinyección, lipofección, fosfato de calcio transfección, electroporación y transfección viral, la transfección biolística puede ofrecer una mano de obra menos intensiva y alternativa eficiente para la transfección de células que no son fácilmente transfectadas con estos otros métodos. De hecho, fue desarrollado como una técnica de transferencia de genes en las plantas ya que la presencia de la pared celular hecho difícil transfección mediante métodos preexistentes ^1. Del mismo modo, biolística ha ganado popularidad en el campo de la neurobiología ya que las neuronas post-mitóticas son muy difíciles de transfectar ^2,3. En particular, es ampliamente reconocido como la técnica de principio a ser utilizados en experimentos destinados a evaluar la morfología fina de neuronas individuales en rodajas de cerebro intacto. Los métodos descritos aquí dar una explicación completa y detallada de cómo llevar a cabo la transfección biolística de rodajas de cerebro de cultivo con una mano gen-gun (el sistema Helios Gene Gun Bio-Rad).

Transfección biolística se ha convertido en el método preferido para la transfección de las neuronas en la cultura de corte, ya que permite la transfección de un escaso número de células a lo largo de la porción del cerebro. De esta manera, las neuronas individuales pueden examinarse de manera aislada. Dado que esta técnica es especialmente adecuado para la transfección de las neuronas en cortes de cerebro, a menudo se utiliza en combinación con 2-fotón microscopio, ya que dos fotones de excitación permite la visualización de las células de la etiqueta fluorescente en lo profundo de los tejidos dispersión de la luz ^4. De hecho las imágenes de gran aumento de las neuronas piramidales única presentada a través de este vídeo se capturaron con una hecha a la medida de 2 fotones microscopio de barrido láser. En conclusión transfección biolística es un medio eficaz para la transfección de células individuales en el contexto de una alta densidad de las células circundantes, y como tal ha demostrado ser extremadamente útil para la fluorescencia de etiquetado neuronas individuales en la cultura de corte neuronal.

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