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Resumen

Este artículo describe cómo crear pulmones de ratón de bioingeniería utilizando métodos de descelularización y recelularización. También se detalla el posterior trasplante ortotópico de pulmón.

Resumen

El trasplante de pulmón es un tratamiento fundamental para los pacientes con enfermedades pulmonares terminales, como la fibrosis pulmonar idiopática, pero persisten desafíos como la escasez de donantes y las complicaciones posteriores al trasplante. Los pulmones de bioingeniería, que integran células específicas del paciente en andamios animales descelularizados, presentan una alternativa prometedora. A pesar de los avances en el uso de pulmones de bioingeniería en modelos animales, la funcionalidad y la estructura siguen siendo inmaduras. Este protocolo aborda una barrera crítica en la bioingeniería de órganos: la necesidad de una plataforma experimental rentable. Al utilizar modelos de ratón en lugar de animales más grandes como ratas o cerdos, los investigadores pueden reducir significativamente los recursos necesarios para cada experimento, acelerando el progreso de la investigación.

El protocolo describe un procedimiento detallado para la bioingeniería pulmonar utilizando bloques corazón-pulmón de ratón y células primarias humanas, centrándose en la estrategia de aislamiento para el bloqueo corazón-pulmón de ratón, la descelularización, la configuración del biorreactor, el cultivo de órganos basado en la perfusión y el trasplante ortotópico de pulmones de bioingeniería. Esta plataforma a escala de ratón no solo reduce los costos experimentales, sino que también proporciona un marco viable para optimizar los tipos y números de células para la recelularización, probar diferentes tipos de células utilizando métodos histológicos y moleculares y garantizar el flujo sanguíneo después del trasplante. El método tiene potencial para amplias aplicaciones, incluido el estudio de las interacciones celulares en condiciones de cultivo tridimensionales, las interacciones célula-matriz y el modelado ex vivo del cáncer, avanzando así en el campo de la bioingeniería de órganos.

Introducción

El trasplante pulmonar ha sido la cura decisiva para los pacientes con enfermedad pulmonar terminal1 como la fibrosis pulmonar idiopática, en la que el tratamiento farmacológico es ineficaz para detener el deterioro de la función respiratoria. Cada año se suman más pacientes elegibles a la lista de espera; Sin embargo, el número de donaciones de órganos de donantes fallecidos ha ido a la zaga del creciente número de pacientes en espera 2,3. Incluso después de someterse a un trasplante de pulmón, bastantes problemas degradarían la función de los pulmones trasplantados, incluida la disfunción de los órganos primarios, el síndrome alogénico reactivo y las infecciones, que disminuyen significativamente la supervivencia a 5 años de los receptores del trasplante de pulmón4.

Existen varias opciones para contrarrestar los problemas actuales en el trasplante de órganos, incluyendo la utilización de donantes marginales5, la recuperación de pulmones de donantes en un sistema de perfusión pulmonar ex vivo 6, y el xenotrasplante usando cerdos editados genéticamente7. Estas alternativas pueden ampliar el grupo de donantes de órganos; Sin embargo, ninguno puede abordar por completo la escasez, la inmunogenicidad y la heterogeneidad funcional de los órganos del donante.

Está lejos de la realidad, pero los órganos artificiales de bioingeniería, donde las células específicas del paciente se integran en el andamio de órganos animales descelularizados, son una fuente potencial fascinante de trasplante de órganossólidos. Desde 2010 se han reportado varios estudios pioneros que demostraron la utilidad potencial de los pulmones de bioingeniería 9,10. En estos estudios, los pulmones de ratas o cerdos fueron descelularizados por detergentes, las células animales o humanas fueron inyectadas desde la tráquea o vasculatura pulmonar para regenerar el tejido pulmonar en el biorreactor basado en perfusión, y algunas de ellas fueron trasplantadas ortotópicamente a las cavidades torácicas de los animales 11,12,13,14,15. Sin embargo, la función y la estructura de los pulmones de bioingeniería fueron prematuras, presumiblemente debido al número inadecuado de células cultivadas en el biorreactor o a uniones intercelulares menos integradas.

Un obstáculo para avanzar en la investigación en bioingeniería de órganos es la falta de una plataforma experimental a pequeña escala. Si bien las ratas o los cerdos son los animales comúnmente utilizados en este campo, requieren >108 células pulmonares por pulmón16, lo cual es muy costoso para los laboratorios académicos. Si los ratones están disponibles para la investigación en bioingeniería de órganos, podríamos reducir drásticamente el costo de cada experimento y acelerar el programa de investigación. Aunque existen diferencias anatómicas entre los pulmones de ratón y los pulmones humanos17, la arquitectura básica del pulmón es similar en todos los mamíferos18. Por lo tanto, los resultados de los experimentos a escala de ratón se pueden aplicar a animales más grandes simplemente multiplicando el número según el tamaño del cuerpo.

Este protocolo tiene como objetivo describir el procedimiento experimental detallado de bioingeniería pulmonar utilizando bloques corazón-pulmón de ratón y células primarias humanas19. Para este estudio adoptamos el protocolo de descelularización pulmonar en ratones, previamente reportado y ampliamente utilizado20,21,22. La parte desafiante de la bioingeniería pulmonar es la recelularización de la vasculatura capilar descelularizada20; Por lo tanto, en este protocolo se utilizarán células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano.

Protocolo

Todos los experimentos siguieron el Reglamento para Experimentos con Animales y Actividades Relacionadas de la Universidad de Tohoku (15ª edición), publicado por la Universidad de Tohoku23. Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tohoku (#2020AcA-041-01).

1. Preparación de materiales para la descelularización

  1. Preparación de soluciones de descelularización (formato de 1.000 mL en frasco de vidrio esterilizable en autoclave de 1 L)
    1. Agua desionizada estéril (DI): Agregue 1,000 mL de agua destilada o DI a botellas de vidrio esterilizables en autoclave de 1 L. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
    2. Triton X-100: Agregue 1 mL de Triton X-100 a 1,000 mL de agua desionizada estéril en una botella de vidrio esterilizable en autoclave de formato 1 L. (Opcional) Añadir 10 mL de solución de Penicilina y Estreptomicina (concentración final, 500 unidades/mL de penicilina y 500 μg/mL de estreptomicina).
      NOTA: No lo haga en autoclave.
    3. Desoxicolato de sodio: Añadir 20 g de desoxicolato de sodio en polvo a 1.000 mL de agua desionizada estéril en un frasco de vidrio esterilizable en autoclave de 1 L. Cierre la tapa y voltee el frasco para solubilizar el polvo. (Opcional) Agregue 10 mL de solución de penicilina y estreptomicina.
      NOTA: No lo haga en autoclave.
    4. 1 M de NaCl: Añadir 58,44 g de NaCl a 1.000 mL de agua destilada o desionizada en una botella de vidrio esterilizable en autoclave de 1 L. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
    5. Solución madre de DNasa I: Diluir a una concentración de 10 mg/mL en el medio A.
      1. Medio A: Prepare 5 mM de CaCl2 (5 mg de CaCl2 en 9 mL de agua desionizada estéril) y dilución 1:10 con agua desionizada estéril.
    6. Solución de trabajo de DNasa I: Añadir 33 μL de solución madre de DNasa I a 10 mL de medio B.
      1. Medio B: Prepare 10x Medio B (155 mg de MgSO4 + 220 mg de CaCl2 en 100 mL de agua desionizada estéril) y dilución 1:10 con agua desionizada estéril.
  2. Preparación de los catéteres para la arteria pulmonar (AP) y la tráquea (procedimiento estéril)
    1. Corte el catéter PA (catéter para la vena yugular de rata) a una longitud de aproximadamente 15 mm.
    2. Mueva el collar hasta el extremo del catéter.
    3. Inserte un conector de catéter en el catéter PA y conéctelo a un inyector. Los catéteres de PA preparados se presentan en la Figura 1A.
    4. Guarde el catéter PA en etanol al 70% hasta su uso.
    5. Corte el catéter intravenoso de 20 G a una longitud aproximada de 15 mm. Se utiliza para un catéter traqueal.
  3. Cirugía con ratones para la extracción de un bloqueo cardiopulmonar
    1. Sacrificar a un ratón macho (C57BL/6, peso > 28 g) con una sobredosis de dióxido de carbono o isoflurano.
    2. Coloque el ratón en posición supina sobre una mesa quirúrgica y fije las extremidades. Esterilizar rociando etanol al 70% en la superficie del tórax y el abdomen.
    3. Abra la cavidad abdominal en la línea media del cuello con unas tijeras de acero inoxidable y parta el esternón con las tijeras. Resecar el diafragma de la pared torácica, cortar la pared torácica ventral para exponer completamente las cavidades torácicas y extirpar el timo. Ligue la vena cava inferior y la vena cava superior derecha con una seda 4-0 para prevenir la regurgitación de PBS en el paso 1.3.5, mejorando así el lavado de la sangre en la vasculatura pulmonar.
    4. Cortar la aorta abdominal con unas tijeras inoxidables para el drenaje. Si la aorta abdominal es indiscernible, corte la vena cava inferior y la aorta abdominal por completo.
    5. Inyecte 3 mL de PBS estéril desde el ventrículo derecho con una jeringa estéril de 5 mL con una aguja de 27 G perforando la pared del ventrículo derecho.
    6. Enrolle el PA principal con una seda 4-0 con pinzas Dumont.
      NOTA: La PA principal y la aorta ascendente se pueden unir en bucle.
    7. Abra una ventana de 2 mm debajo de las válvulas PA cortando la pared del ventrículo derecho con unas tijeras de resorte.
    8. Inserte el catéter PA a través de la ventana y asegure la seda 4-0 previamente enrollada (Figura 1B).
      NOTA: Evite tocar el sistema de megafonía durante este procedimiento, ya que podría dañar la pared del sistema de megafonía. La PA principal y la aorta ascendente se pueden ligar y asegurar juntas.
    9. Inyecte 2 mL de PBS lentamente a través del catéter PA con una jeringa estéril de 5 mL. Asegúrese de que ambos pulmones se expandan ligeramente a medida que se inyecta el PBS.
    10. Cánula de la tráquea con un catéter traqueal y amarrándola con una sutura de seda 4-0 (Figura 1C).
    11. Inyecte 2 mL de aire lentamente a través del catéter traqueal con una jeringa estéril vacía de 5 mL y manténgala presionada durante 10 s. Asegúrese de que no haya fugas de aire de los pulmones.
    12. Extirpa el corazón y el pulmón en bloque. Agarre la tráquea con las pinzas de Dumont y con el catéter traqueal adentro, corte el esófago cervical y diseccione de las vértebras. Cortar las venas y arterias subclavias bilaterales. Por último, corte el esófago y la infravena cava a nivel del diafragma.
      NOTA: No toque la superficie pulmonar con ningún instrumento. Cualquier ligero contacto podría provocar una fuga de aire.
  4. Descelularización de los pulmones del ratón (procedimiento de 3 días)
    NOTA: Todos los procedimientos de la sección 1.4 deben realizarse en una cabina de bioseguridad limpia.
    1. Día 1
      1. Transfiera el bloque corazón-pulmón resecado a una placa de Petri de plástico de 10 cm de diámetro e incube los bloques corazón-pulmón en agua desionizada estéril durante 1 h a 4 °C.
      2. Inyecte 2 mL de agua DI estéril a través del catéter de tráquea 3x y 2 mL de agua estéril a través del catéter PA con una jeringa estéril de 5 mL. Haga una pausa después de cada inyección para permitir que el líquido salga a medida que el pulmón retrocede (Figura 1C).
        NOTA: Inyecte agua a aproximadamente 0,5 mL/s.
      3. Inyecte 2 mL de solución Triton X-100 al 0,1% en el catéter traqueal y 2 mL en el catéter PA.
      4. Coloque el bloque corazón-pulmón en la placa de Petri e incube estáticamente en la solución Triton X-100 durante la noche a 4 °C.
    2. Día 2
      1. Retire la solución Triton X-100 de los pulmones con agua desionizada estéril como se describe en el paso 1.4.1.2.
      2. Inyecte 2 mL de solución de desoxicolato de sodio al 2% en el catéter traqueal y 2 mL en el catéter PA. Incubar en solución de desoxicolato durante 24 h a 4 °C.
    3. Día 3
      1. Retire la solución de desoxicolato de sodio de los pulmones con agua desionizada estéril como se describe en el paso 1.4.1.2.
      2. Inyecte 2 mL de solución de NaCl 1 M en el catéter traqueal y 2 mL en el catéter PA. Incubar en solución de NaCl durante 1 h a RT.
      3. Retirar de la solución de NaCl con agua desionizada estéril como se describe en el paso 1.4.1.2.
      4. Inyecte 2 mL de solución de trabajo de ADNasa I en el catéter traqueal y 2 mL en el catéter PA. Incubar en solución de trabajo de DNasa durante 1 h en RT.
      5. Extraer la solución de DNasa de los pulmones como se describe en el paso 1.4.1.2 pero con PBS estéril. Confirmar que los pulmones están blancos y transparentes en el borde después del procedimiento de descelularización.
        NOTA: A medida que avanza el procedimiento de descelularización, el pulmón se vuelve más frágil. Manipule siempre el bloqueo corazón-pulmón con precaución y evite tocar la superficie pulmonar. Después de la descelularización, los bloqueos corazón-pulmón pueden almacenarse en PBS/antibióticos a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.

2. Cultivo de células primarias humanas

  1. Mezcle el Medio de Crecimiento de Células Endoteliales-2 (EGM2) y el Bullet Kit que contiene suero fetal bovino (concentración final, 2%), hidrocortisona (concentración final, 0,2 μg/mL), factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos (concentración final, 4 ng/mL), factor de crecimiento endotelial vascular (2 ng/mL), factor de crecimiento similar a la insulina R3-1 (concentración final, 5 ng/mL), ácido ascórbico (concentración final, 75 μg/mL), factor de crecimiento epidérmico humano (concentración final, 10 ng/mL), gentamicina/anfotericina-1000 (concentración final, gentamicina: 30 μg/mL, anfotericina: 15 ng/mL) y heparina (concentración final, 1 ng/mL).
  2. Descongele 2 × 106 células endoteliales de la vena del cordón umbilical humano (HUVEC) en viales congelados en un baño de agua a 37 °C.
  3. Mezclar las células con EGM2 en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 500 × g durante 5 min.
  4. Cuente las células y subcultive a una densidad celular adecuada (se recomienda 2,0 x 104 células/cm2 ). Comience con placas de formato de 6 pocillos y luego transfiera a matraces T75.
  5. Pase las celdas hasta obtener el número requerido de celdas.
    NOTA: Para una cobertura vascular pulmonar completa con HUVEC, se requerirán 3 × 107 HUVEC19.

3. Configuración del biorreactor y cultivo de órganos de perfusión

  1. Preparación de una cámara de órganos y un depósito de células
    1. Corte agujeros en un tapón de silicona con un barrenador de corcho, como se muestra en la Figura 2A. Los tamaños de los orificios son de 5 mm (i, ii y iii) y 7 mm (iv y v). Cada número de agujero (i-v) de la Figura 2A corresponde a los números de agujero de la Figura 2B.
    2. Inserte el tubo de la bomba a través del tapón de silicona como se indica en la Figura 2B.
    3. Corte un agujero de 5 mm en un tabique de silicona de un tapón de rosca abierto con un barrenador de corcho. Inserte un tubo curado con platino L/S 14 en el orificio (Figura 2B, C).
    4. Autoclave los materiales anteriores, incluido el tapón de silicona con tubo, el recipiente de vidrio, el tapón de rosca GL-45 con tubo, una botella de vidrio esterilizable en autoclave de 250 mL y un tubo L/S 14 con accesorios de señuelo (Tubo B y Tubo C en la Figura 3A) durante 20 minutos a 121 °C. Seleccione los accesorios de señuelo adecuados para asegurarse de que los tubos B y C formen un bucle.
      NOTA: El recipiente de vidrio se usa para una cámara de órganos, y el frasco de vidrio de 250 ml se usa para un depósito de celdas.
  2. Montaje de circuito de biorreactor basado en perfusión
    NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en un banco limpio.
    1. Agregue 70 mL de medio de cultivo al recipiente de vidrio y luego coloque el tapón de silicona encima del recipiente de vidrio.
    2. Ensamble un tapón de silicona, un recipiente de vidrio, un tapón de rosca GL-45 con tubo, una botella de vidrio esterilizable en autoclave de 250 mL y un tubo L/S 14 con accesorios de señuelo utilizando llaves de paso de tres vías como se describe en la Figura 3A. Inserte una aguja de 20 G en un tabique de silicona de un tapón de rosca GL-45.
    3. Llene el medio en los tubos A, B y C con una jeringa de 10 mL conectada a las llaves de paso i) y iii) (se necesitarán ~ 3-5 mL de medio para llenar 1 m de tubo). Repita la inyección y extracción del medio con una jeringa de 10 ml a través de una llave de paso de tres vías para asegurarse de que no haya burbujas de aire dentro del tubo.
    4. Conecte el catéter PA del bloque corazón-pulmón descelularizado a través de un accesorio de señuelo conectado al tubo C. Evite las burbujas de aire en el catéter o el tubo.
    5. Coseche y resuspenda HUVECs a una densidad de 0,5-1 × 106 células/mL en EGM2. Agregue la suspensión de celdas del paso 2.5 al depósito de celdas.
      NOTA: La suspensión de la célula se prepara preferiblemente entre los pasos 3.2.4 y 3.2.5. Coloque una barra agitadora en el depósito de celdas.
  3. Inyección por gravedad de células endoteliales
    1. Coloque el depósito de celdas que contiene HUVEC en un agitador magnético. Asegúrese de que el fondo del depósito celular esté a 30 cm por encima de la cámara del órgano (Figura 2D y Figura 3A).
    2. Encienda el agitador magnético a una velocidad de aproximadamente 120 rpm.
    3. Abra la llave de paso i) y ii) para que la suspensión celular pueda inyectarse en el andamio descelularizado a través del tubo A, el tubo C y el catéter PA.
      NOTA: Al inyectar 3 × 107 células a una densidad celular de 1 × 106 células/mL, el volumen de la suspensión celular debe ser de 30 mL. Una tasa de inyección típica es de 1-2 mL/min.
    4. Después de inyectar completamente la suspensión de la celda, separe el tubo A de la llave de paso ii).
      NOTA: El recuento de células se puede realizar en este paso para medir la tasa de retención de células en el andamio descelularizado. La tasa típica de retención celular es del 80-90%, independientemente del número de células inyectadas19.
      La calidad del andamio pulmonar descelularizado determina estrictamente la tasa de retención celular. Cualquier fuga del pulmón descelularizado (por ejemplo, de la AP principal, la superficie pulmonar) da lugar a una menor tasa de retención celular. Asegúrese de que no haya fugas aparentes del pulmón descelularizado inyectando 2-3 ml de medio de cultivo con una jeringa estéril conectada a una de las llaves de paso en el biorreactor basado en perfusión y confirme que los pulmones descelularizados se expanden ligeramente a medida que se inyecta el medio.
  4. Cultivo de órganos de perfusión
    1. Coloque la cámara del órgano en una incubadora deCO2 .
    2. Fije el tubo B a un cabezal de bomba conectado a una bomba pulsátil.
    3. Cierre la puerta de vidrio de la incubadora deCO2 . Asegúrese de que el tubo esté colocado correctamente entre la puerta de vidrio y el sello de goma (Figura 3B).
    4. Incubar el andamio descelularizado a 37 °C durante 3 h para que las células endoteliales inyectadas se asienten en el andamio.
      NOTA: Asegúrese de que la bomba pulsátil esté siempre apagada entre los pasos 3.4.1 y 3.4.4.
    5. Arranque la bomba a una velocidad de 6 rpm, lo que da como resultado una perfusión de medio de 2 mL/min utilizando un tubo L/S 14. Observe cómo el pulmón descelular se expande ligeramente con la perfusión del medio.
    6. Cierre la puerta de la incubadora (Figura 3C).
    7. Realice el cambio de medios a través de Stopcock iii). Cambie la mitad del medio cada 2 o 3 días.
      1. Detenga el accionamiento de la bomba, conecte una jeringa estéril de 50 mL a la llave de paso iii) y extraiga 50 mL de medio de la cámara.
      2. Llene otra jeringa estéril de 50 mL con 50 mL de medio precalentado y transfiera el medio a la cámara a través de la llave de paso iii). Conecte la llave de paso correctamente y luego encienda la bomba pulsátil.
    8. Recolectar el bloqueo corazón-pulmón recelularizado después de al menos 2 días de cultivo de órganos de perfusión.
      NOTA: En nuestro estudio, 2 días de cultivo de perfusión fueron suficientes para revascularizar homogéneamente el andamio pulmonar descelularizado utilizando 3 × 107 HUVECs. Cuando se utilizan menos de 3 × 107 HUVEC, podría ser necesaria una incubación más prolongada para mejorar la eficiencia de la recelularización.

4. Trasplante ortotópico de pulmón de bioingeniería

  1. Preparación de medicamentos
    1. Prepare el agente anestésico combinado MMB mezclando midazolam (concentración final, 4 mg/kg), medetomidina (concentración final, 0,75 mg/kg) y tartrato de butorfanol (concentración final, 5 mg/kg) con solución salina normal de grado clínico.
    2. Prepare la solución de heparina mezclándola con solución salina normal de grado clínico (concentración final, 1000 U/mL).
    3. Preparar cefazolina sódica mezclándola con solución salina normal de grado clínico (una dosis, 30 mg/kg).
  2. Procedimiento quirúrgico
    1. Preparación de los puños
      1. Frote ligeramente los tres tipos de angiocatéter con papel de lija fino para facilitar que los vasos permanezcan sujetos.
      2. Prepare un manguito bronquial a partir de un angiocatéter de teflón de 20 G y 1 mm de longitud utilizando un bisturí #11. Antes de cortar el angiocatéter, use la parte posterior del bisturí #11 para hacer una hendidura en el angiocatéter para atar el nailon 10-0.
      3. Prepare el manguito de la vena pulmonar (VP) a partir de un angiocatéter de teflón de 22 G de 0,8 mm de longitud y el manguito de PA de un angiocatéter de teflón de 24 G y 0,6 mm de longitud.
        NOTA: Esta preparación se puede hacer antes del día del experimento.
    2. Fijación del manguito al pulmón de bioingeniería
      1. Coloque el bloqueo corazón-pulmón sobre un pedazo de gasa estéril humedecido con solución salina fría, coloque otro pedazo de gasa seca y limpia debajo y coloque una placa de Petri en una caja de espuma de poliestireno llena de hielo limpio.
        NOTA: La colocación de la gasa seca evita que el bloqueo corazón-pulmón se congele accidentalmente.
      2. Coloque una pinza para aneurisma para asegurar la tráquea y la gasa (Figura 4A). Coloque un pequeño trozo de gasa sobre el corazón, cubriendo también el pulmón derecho. Coloque otra gasa en el pulmón izquierdo. Ajuste esta retracción con la gasa humedecida para exponer el hilio izquierdo con la mayor claridad posible.
      3. Diseccione cuidadosamente las estructuras hiliares entre sí utilizando micropinzas rectas o en ángulo, según su preferencia (Figura 4B). Comience a diseccionar desde el ligamento pulmonar a lo largo del nervio vago. Incidir la pleura visceral por debajo de la VP y mover la aorta descendente y el nervio vago juntos a través de la parte posterior del hilio pulmonar izquierdo hasta el lado craneal.
      4. Diseccionar la PA principal izquierda desde el tronco pulmonar hasta el borde mismo del pulmón izquierdo (Figura 4C). A continuación, divida el PA a nivel del tronco pulmonar para obtener la longitud adecuada.
      5. Diseccionar el PV izquierdo desde el lado izquierdo de la aurícula izquierda hasta el borde mismo del pulmón izquierdo (Figura 4D). Divida el PV izquierdo a nivel de la aurícula izquierda para obtener la longitud adecuada.
      6. Suspenda el manguito de PA justo por encima del PA con la pinza de estabilización e inserte el PA dentro del manguito (Figura 4E). Pliegue el PA sobre el manguito), exponiendo la superficie endotelial. Asegúrelo alrededor del puño con una corbata de nailon 10-0 (Figura 4F). Coloque el brazalete en el PV de manera idéntica (Figura 4G, H).
      7. Divida el bronquio izquierdo a nivel de la carina. Coloque el manguito en el bronquio de manera idéntica (Figura 4I).
    3. Procedimiento para el ratón receptor
      1. Anestesiar al ratón receptor con una mezcla de MMB i.p. con una aguja de 27 G e intubar insertando un angiocatéter de poliuretano de 20 G bajo un microscopio. Coloque el ratón receptor en un calentador eléctrico de temperatura ajustable en la posición de decúbito lateral derecho y conecte el angiocéter al respirador. Ajuste la configuración del ventilador de la siguiente manera: oxígeno 2 L/min, frecuencia respiratoria 120 lpm, volumen corriente 0,5 mL. Esterilizar la pared torácica con etanol al 70% e inyectar la mezcla de cefazolina s.c.
      2. Incisión en la piel con unas tijeras. Cortar el tejido subcutáneo y los músculos con una cauterización. Abra el tórax a través del3er espacio intercostal y coloque los retractores de tórax.
        NOTA: Aunque la toracotomía debe ser lo suficientemente grande para la implantación, no lesione la arteria mamaria interna, lo que puede provocar un sangrado masivo.
      3. Disecciona el ligamento pulmonar con un hisopo de algodón y unas tijeras de resorte grandes. Coloque un limpiador arterial curvo en el pulmón izquierdo del receptor para retraer el pulmón fácilmente. Con una micropinza en ángulo, diseccione la pleura mediastínica alrededor del hilio pulmonar izquierdo.
        NOTA: La base de la disección de la pleura es similar a la resección pulmonar anatómica de un ser humano.
      4. Diseccionar la AP desde el bronquio utilizando micropinzas curvadas desde el mediastino hasta el borde mismo del pulmón izquierdo (Figura 5A). Diseccione el bronquio de la PV de manera similar.
        NOTA: La disección se puede realizar fácilmente cuando la pleura se disecciona en la maniobra anterior (paso 4.2.3.3).
      5. Coloque un nudo corredizo de seda 10-0 en la base del PA para ocluir (Figura 5B). Coloque una pinza angular delgada para el aneurisma en la base de la VP y el bronquio (Figura 5C).
      6. Enrolle el nailon 10-0 alrededor de los bronquios, PA y PV, dejando sueltos para asegurar los manguitos en los siguientes pasos.
      7. Incidir la PA, el bronquio y la VP del receptor en el borde del pulmón izquierdo del receptor con unas tijeras de microresorte (Figura 5D). Dilatar suavemente la PA y la PV con micropinzas rectas. Extraiga la sangre en el PA y PV con solución salina con una jeringa de 1 mL y un angiocatéter de 24 G.
        NOTA: Las incisiones de PA, bronquios y PV ocupan aproximadamente un tercio del camino. Las micropinzas rectas son suaves y adecuadas para la dilatación.
      8. Coloque el pulmón de bioingeniería, que está cubierto con una gasa humedecida, sobre el pulmón izquierdo del receptor (Figura 5E), lo más cerca posible del mediastino del receptor.
      9. Inserción del manguito de PA del donante en el PA del receptor (Figura 5F).
        NOTA: Habrá un poco de estiramiento en el PA del donante. Si el tamaño de la incisión por PA es el adecuado, es menos probable que el manguito del donante se desplace. Mover el pulmón de bioingeniería cerca del mediastino también evitará que el manguito del donante se desplace.
      10. Asegúrelo alrededor del puño con una corbata de nailon 10-0 (Figura 5G). De manera similar, inserte y asegure el bronquio donante (Figura 5H) y los manguitos VP (Figura 5I,J).
      11. Retire el clip de aneurisma de ángulo delgado (Figura 5L). Observe que la sangre refluye más allá del manguito PV y retire el lazo de seda en PA para reanudar el flujo sanguíneo anterógrado al pulmón de bioingeniería.

Resultados

Siguiendo el protocolo de descelularización, los pulmones de ratón son visiblemente blancos y translúcidos (Figura 6A). Los componentes celulares deben eliminarse por completo, pero la estructura alveolar permanece intacta en la observación histológica (Figura 6B, C). Los pulmones de ratón recelularizados que utilizan 3 × 107 HUVEC con un cultivo de biorreactor basado en perfusión de 2 días m...

Discusión

La bioingeniería de órganos es una empresa exigente. El costoso proceso de selección ha obstaculizado el ciclo de investigación y desarrollo de este campo. Al utilizar ratones como plataforma experimental, el espacio, las células y los medios se reducen significativamente en comparación con la plataforma de ratas utilizada anteriormente. Aunque todavía no se ha logrado la medición de parámetros físicos detallados, como el intercambio de gases, la resistencia vascular o la diste...

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses con respecto a este manuscrito.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo financiero de la Grant-in-Aid for Scientific Research / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, el Fondo para la Promoción de la Investigación Internacional Conjunta (Fostering Joint International Research (B)) #22KK0132 para TS, JSPS KAKENHI Grant Number 21K08877 para TW, Leave a Nest Grant Ikeda-Rika para FT y la Grant-in-Aid for JSPS Fellows #21J21515 para FT. Agradecemos enormemente a la Sra. Maiko Ueda, personal técnico del Centro de Investigación Biomédica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tohoku, por su intensa labor de observación histológica. También agradecemos el asesoramiento técnico de la Sra. Yumi Yoshida y el Sr. Koji Kaji del Centro de Instrumentos de Investigación del IDAC de la Universidad de Tohoku, por su apoyo en el procesamiento de imágenes.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DECELLULARIZATION
27 G x 1/2 in. BD PrecisionGlide NeedleBD305109Or equivalent 27 G injection needle
BD Insyte IV Catheter 20 GA X 1.8 8INBD381237Or equivalent 20 G IV catheter
Blade silk suture (4-0)NescoGA04SBOr equivalent
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Catheter for rat jugular vein, PU 2Fr 10 cmInstechC20PU-MJV1301Recommended for mice weighs 30 g and under.
Catheter for rat jugular vein, PU 3Fr 10 cmInstechC30PU-RJV1307Recommended for mice weighs over 30 g.
DNase ISigma-AldrichDN25
MgSO4Sigma-AldrichM7506
NaClSigma-AldrichS3014
PinPort injectorsInstechPNP3M
PinPorts, 22 GInstechPNP3F22-50Fits C30PU-RJV1307
PinPorts, 25 GInstechPNP3F25-50Fits C20PU-MJV1301
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
Sterile syringe, 5 mLGeneric
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
CELL CULTURE
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial CellsLonzaC2519A
PERFUSION-BASED BIOREACTOR
20 G needleGeneric
3-way stopcockGeneric
Cork borerGenericBoring size, 6-10 mm
EasyLoad III pump headCole-Parmer243934
Glass canisterHarioSCN-200TInner diameter: 80 mm
Heating magnetic stirrerGeneric
Lure fitting, PVDF, For Soft TubeNordson Medical2-9965-01Female, fits tubing with I.D. 1.5 mm (L/S 14)
Lure fitting, PVDF, For Soft TubeNordson Medical2-9964-01Male, fits tubing with I.D. 1.5 mm (L/S 14)
Lure fitting, PVDF, For Soft TubeNordson Medical2-9965-03Female, fits tubing with I.D. 3 mm (L/S 16)
Lure fitting, PVDF, For Soft TubeNordson Medical2-9964-03Male, fits tubing with I.D. 3 mm (L/S 16)
Magnetic stirring barGeneric
Masterflex L/S Digital Precision Modular Drive with Remote I/O and Benchtop ControllerCole-Parmer07557-00
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharMed BPT, L/S 16Cole-Parmer06508-16
Masterflex L/S Pricision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14Cole-Parmer96410-14
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilizedMilliporeSLGPR33RS
Pyrex 250 mL grass bottle, GL-45 screw capCorning1395-250
Silicon Septa for GL45 Open Top PBT Screw CapCorning1395-455S
Silicone Light StopperIMG07763-18Upper diameter: 87 mm, Lower diameter: 75 mm
Sterile syringe, 10 mL, 50 mLGeneric
MOUSE SURGERY (Isolation of the heart-lung block | Lung transplantation)
10-0 Nylon tiesKono SeisakushoN/A
10-0 Silk tiesKono SeisakushoN/A
4-0 Silk tiesKono SeisakushoN/A
Arterial clamp, 45 mm curved, groovedNatsume seisakusyoC-17-45
BD Insyte IV Catheter 24GABD381512Or equivalent 24G i.v. catheter
Bulldog Vascular Forceps 45mm curvedNatsume seisakusyoM2
Butorphanol tartrate Meiji Seika PharmaN/A
Cefazolin SodiumOtsuka PharmaceuticalN/A
Dumont forceps #5/45Fine Science Tools1251-35
Fine vannas style spring scissorsFine Science Tools15403-0845° tip, 0.01 x 0.06 mm
Gemini Cautery KitHarvard ApparatusRS-300
Halsted-Mosquito clamp curved tip, 125 mmBioresearch center16181670
Hegar needle holder, 150 mmB Braun/AesculapBM065R
Heparine solutionMochida SeiyakuN/A
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoN/A
Micro forceps straightB Braun/AesculapBD33R
MidazolamSandozN/A
Mouse VentilatorHarvard ApparatusModel 687™
Normal Saline, Clinical gradeOtsuka PharmaceuticalN/A
Petri dish, 60 x 15 mmBD351007
Safelet Cath PU 20 gauge polyurethan catheterNipro09-031
Sakaki stainless scissors curved 14 cmBioresearch center64152034
Scalpel holderBioresearch center16101040
Small animal retraction systemFine Science Tools18200-20
Spare blade scalpel #11Muranaka Medical Instruments567-001-03
Spring scissors, 15 cmBioresearch centerPRI13-3736
StereomicroscopeLeica MicrosystemsM525Clinical-grade surgical microscope with a flexible arm system is preferable.
Sugita titanium aneurysm clip curved slim, No.98Mizuho medical17-001-98
Sugita titanium clip applier, 110 mmMizuho medical17-013-53
Temperature-adjustable electric warmerGeneric
Ultrafine cotton swabGeneric
VASCULAR AND BRONCHIAL CUFF
Fine sandpaperGeneric
Venula 20 gauge Teflon angiocatheterTop1160
Venula 22 gauge Teflon angiocatheterTop1161
Venula 24 gauge Teflon angiocatheterTop1124

Referencias

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