Un modelo adoptivo de transferencia de artritis reumatoide en ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que establece un modelo de ratón con artritis reumatoide (AR) a través de la transferencia adoptiva de células T CD4⁺ de ratones SKG, proporcionando una herramienta experimental rápida y confiable para investigar los mecanismos inmunológicos, la progresión patológica y el desarrollo de nuevos tratamientos para la AR.

Resumen

La artritis reumatoide (AR) es un trastorno inflamatorio autoinmune sistémico crónico que puede provocar daño articular, deformidades, discapacidad e incluso la muerte. Debido a su compleja etiología y heterogénea presentación clínica, las estrategias de tratamiento actuales siguen siendo inadecuadas para controlar eficazmente la progresión de la enfermedad, en particular para lograr un diagnóstico precoz y proporcionar terapias personalizadas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos es crucial. Para lograr esto, los modelos animales confiables son esenciales para investigar la patogénesis de la AR. En la actualidad, se utilizan varios modelos animales de AR, como el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), el modelo K/BxN y el ratón SKG. Aunque estos modelos pueden imitar con éxito los mecanismos inmunitarios y las manifestaciones clínicas de la AR, cada uno de ellos tiene limitaciones notables.

En este protocolo, describimos el proceso de establecer un modelo de ratón con AR a través de la transferencia adoptiva de células T CD4⁺ de ratones SKG. En comparación con los modelos convencionales, este modelo ofrece un tiempo de establecimiento más corto y una mayor tasa de incidencia (100%) en ratones C57BL/6. Es relativamente rentable, implica procedimientos sencillos y replica de forma fiable las respuestas inmunitarias mediadas por células T, lo que garantiza un control experimental y una reproducibilidad superiores. Realizamos una evaluación exhaustiva del modelo, valorando el fenotipo clínico como los síntomas articulares. A través de la evaluación clínica del fenotipo, observamos una hinchazón articular significativa y respuestas inflamatorias. Además, utilizando la tecnología de PCR para medir los niveles de expresión de factores de transcripción clave, descubrimos que este modelo simula eficazmente las respuestas inmunitarias mediadas por células T y las características patológicas clave de la AR. Con este modelo, los investigadores pueden simular mejor la respuesta inmunitaria mediada por células T y las características patológicas clave de la AR, proporcionando así una herramienta experimental fiable y eficaz para estudiar los mecanismos inmunitarios y la progresión patológica y desarrollar nuevas terapias para la AR.

Introducción

La AR es una enfermedad inflamatoria autoinmune crónica y sistémica que afecta aproximadamente al 1% de la población mundial, causando una alta morbilidad y una fuerte carga socioeconómica ^1,2. La enfermedad se caracteriza por inflamación sinovial persistente, destrucción del cartílago y erosión ósea, lo que en última instancia conduce a deformidades articulares, discapacidades y, en casos graves, muerte prematura ^3,4,5. La patogenia de la AR implica la interacción de factores genéticos, ambientales e inmunológicos, con características clave que incluyen la activación anormal de la inmunidad celular, la liberación excesiva de citocinas proinflamatorias y la interrupción de la tolerancia inmune ^6,7. En este proceso, las células T autorreactivas, en particular las células T CD4⁺, como impulsores clave de la regulación inmunitaria, promueven directamente la progresión patológica de la AR a través de múltiples mecanismos.

Las células T auxiliares (Th)1 producen interferón-gamma (IFN-γ), que activa los macrófagos y los fibroblastos sinoviales, lo que provoca la liberación del factor de necrosis tumoral (TNF)-α e interleucina (IL)-6 y causa sinovitis. Las células Th17 secretan IL-17, que promueve la activación de las células sinoviales y los osteoclastos, exacerbando la destrucción del cartílago y la erosión ósea ^8,9. Además, los linfocitos T CD4⁺ amplifican las respuestas inflamatorias mediante la activación de los linfocitos B a través de señales coestimuladoras, induciendo la producción de anticuerpos anti-proteínas citrulinadas (ACPA) y factores reumatoideos (FR)¹⁰. Mientras tanto, los defectos en la función y la reducción en el número de células Treg son razones clave para el desequilibrio inmunológico en la AR, lo que conduce a una inflamación incontrolada^11,12. Debido a la compleja etiología y a la heterogénea presentación clínica, el diagnóstico precoz es difícil y el tratamiento actual de la AR es insatisfactorio. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos es crucial. Los modelos animales fiables son fundamentales para investigar la patogénesis de la artritis reumatoide con el fin de obtener una comprensión más profunda de los posibles mecanismos de la artritis reumatoide y explorar nuevas estrategias de tratamiento.

Los modelos tradicionales de AR, como los modelos de ratón CIA y K/BxN 13,14,15, contribuyen a mejorar nuestra comprensión de la AR. Sin embargo, estos modelos muestran limitaciones significativas. Por ejemplo, el modelo CIA en ratones C57BL/6 tiene una baja tasa de éxito y un largo período de inducción, lo que disminuye su utilidad en ciertos entornos experimentales. Del mismo modo, aunque el modelo K/BxN es valioso, es costoso de establecer y tiene limitaciones para replicar la compleja patología de la artritis reumatoide humana, en particular las interacciones entre las células inmunitarias y las citocinas.

Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un nuevo modelo de ratón con AR mediante la transferencia de células T CD4⁺ de ratones SKG con un fondo C57BL/6 a ratones C57BL/6 inmunocompetentes, en combinación con la activación inmunitaria inducida por manano. Este modelo replica eficazmente las características clave de la AR, incluidas las respuestas inmunitarias mediadas por células T y las características patológicas esenciales, como la inflamación sinovial y la erosión articular, al tiempo que ofrece ventajas en reproducibilidad, simplicidad y rentabilidad. Describimos una metodología detallada para establecer este modelo, que incluye la generación de ratones SKG en el fondo C57BL/6, el aislamiento de células T CD4⁺ a partir de ratones SKG, su transferencia adoptiva y la posterior inducción por manano. Además, describimos los criterios clínicos e histológicos utilizados para evaluar la gravedad de la artritis, asegurando su fiabilidad y reproducibilidad. Al imitar sistemáticamente las respuestas inmunitarias mediadas por células T y las características patológicas fundamentales de la AR, este modelo sirve como una herramienta experimental sólida y eficiente para investigar los mecanismos inmunitarios, la progresión de la enfermedad y el desarrollo de nuevas terapias para la AR.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales de este estudio siguieron estrictamente las pautas establecidas por la "Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio", incluida la cría de animales, las operaciones experimentales y la eutanasia, y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Facultad de Medicina de Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong.

1. Animales

1. Generación de ratones SKG (fondo C57BL/6)
   1. Estrategia de edición genética
      1. Diseñar un ARN guía específico (ARNg) dirigido al gen ZAP70 (secuencia de ARNg: 5'-CAGCCCACGAGCGAATGCCCTGG-3') y realizar la edición génica con el sistema CRISPR/Cas9. Diseñar un ADN de donante con la mutación ZAP70(W163C) para asegurar la incorporación precisa de la mutación (aquí, CAGGCCCCACAGGTGGAGAAGCTCATTG
         CTACCACAGCCCACGAGCGAATGCCCTG
         CTATCACAGCAGCCTGACTCGTGAGGAG
         GCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCA).
         NOTA: El ARNg dirige la proteína Cas9 al sitio específico del gen ZAP70 para un corte preciso. La base subrayada en la secuencia de ADN del donante indica bases mutadas. Esta mutación corresponde a la mutación W163C (TGG→TGC) en la proteína ZAP70, que se encuentra en un dominio funcional crítico.
   2. Inyección de microjeringa
      1. Utilice la microinyección para introducir el ARNm, el ARNg y el ADN del donante Cas9 en óvulos de ratón C57BL/6 fertilizados. Co-inyectan la proteína Cas9 y el ARNg para que escindan el gen ZAP70 e insertan la mutación ZAP70(W163C) a través de la recombinación homóloga. Trasplantar los óvulos fertilizados inyectados a ratones hembra pseudopreñados, esperar aproximadamente 20 días y designar a los ratones nacidos como la generación F0. Identificar genotipos mediante amplificación y secuenciación por PCR (ver paso 1.1.5.3).
   3. Genotipado de ratones de la generación F0
      1. Realice la PCR y la secuenciación en ratones de generación F0 para confirmar la adquisición de la mutación ZAP70 (W163C) (consulte el paso 1.1.5.3).
         NOTA: Los ratones de la generación F0 son quiméricos debido a la rápida escisión embrionaria. Pueden carecer de transmisión genética estable. Implementar la cría en serie para establecer líneas estables.
   4. Adquisición e identificación genotípica de ratones de la generación F1
      1. Criar ratones F0 positivos con ratones C57BL/6J de tipo salvaje para obtener ratones de generación F1 y realizar el genotipado mediante PCR y secuenciación para obtener ratones SKG (antecedentes de C57BL/6; consulte el paso 1.1.5.4).
   5. Métodos de genotipado basados en PCR para generaciones F0 y F1
      1. Extraer un trozo de 0,5 cm de la cola con unas tijeras estériles.
      2. Extraiga el ADN del ratón utilizando un kit de extracción de ADN genómico animal.
      3. Para F0, prepare el siguiente sistema de reacción de PCR: 13,2 μL de ddH₂O, 2 μL de tampón de PCR, 2 μL de dNTP de 2,5 mM, 0,5 μL de cada uno de los cebadores directos (5'-GATGCCTAGGGGTGGGGTTCC-3') e inversos (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,8 μL de ADN polimerasa y 1 μL de ADN genómico (50-100 ng/μL) extraído de colas de ratón, para un volumen de reacción final de 20 μL. Realice la amplificación génica utilizando el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 3 min; 98 °C durante 15 s, 58 °C durante 15 s y 68 °C durante 1 min, durante 35 ciclos; 68 °C durante 5 min; mantener a 12 °C.
      4. Para F1, prepare el siguiente sistema de reacción de PCR: 14,9 μL de ddH₂O, 2 μL de tampón de PCR Taq 10x, 1 μL de dNTP de 2,5 mM, 0,5 μL de cada uno de los cebadores directos (5'-GATGCCTAGGTGGGGGGGGTTCC-3') e inversos (5'-ACTTGCCTACGCTACTGCTCTACA-3') (10 pmol/μL), 0,1 μL de ADN polimerasa Taq y 1 μL de ADN genómico (50-100 ng/μL) extraído de colas de ratón, para un volumen de reacción final de 20 μL. Realice la amplificación génica utilizando el siguiente programa de PCR: 94 °C durante 5 min; 94 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min, repetido durante 35 ciclos; 72 °C durante 5 min; mantener a 12 °C.
      5. Ejecute la electroforesis para confirmar los productos del tamaño esperado.
      6. Secuenciar los productos de PCR para verificar tanto el genotipo como la mutación específica.
2. Selección de ratones donantes y receptores
   1. Seleccione ratones SKG de 6 a 8 semanas de edad (macho o hembra) como ratones donantes.
   2. Seleccione ratones C57BL/6 que tengan entre 6 y 8 semanas de edad (preferiblemente hembras para obtener resultados experimentales consistentes) como ratones receptores.
   3. Aloje ratones C57BL/6 y SKG (6-8 semanas de edad) en condiciones de SPF en jaulas ventiladas individualmente. Proporcione acceso gratuito a alimentos de grado SPF y agua estéril en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Aclimata a los ratones durante 1 semana antes de comenzar los experimentos.

2. Aislamiento y purificación de linfocitos T CD4⁺ de ratones SKG

1. Eutanasia de los ratones SKG bajo una campana de flujo laminar estéril utilizando asfixia con CO₂ . Sumerja los ratones en alcohol al 75% durante 5 minutos para desinfectarlos. Localiza el bazo en la cavidad abdominal, así como los ganglios linfáticos (inguinales y poplíteos) en las regiones inguinal y poplítea. Diseccione cuidadosamente el bazo y los ganglios linfáticos con pinzas y tijeras estériles y transfiéralos inmediatamente a PBS preenfriado.
2. Coloque el bazo y los ganglios linfáticos en placas de Petri separadas. Presione los tejidos a través de un colador de células de 70 μm utilizando el émbolo de una jeringa estéril y agregue gradualmente 10-12 mL de PBS preenfriado para formar una suspensión celular uniforme. Pase la suspensión celular a través del mismo filtro celular de 70 μm a un tubo de centrífuga de 15 mL, luego centrifugue a 300 × g durante 7 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y conserve el pellet de celda.
3. Realizar la tinción con azul de tripano para evaluar la viabilidad celular. Cuente las celdas y confirme que la viabilidad es ≥90%.
4. Ajuste la concentración de células a 1 × 10⁸ células/ml con el tampón suministrado en el kit de aislamiento de células T CD4⁺ .
5. Transfiera 100 μL de la suspensión celular (10⁷ celdas) a un tubo nuevo. Añadir 10 μL de Biotina-Anticuerpo-Cóctel, mezclar bien e incubar en hielo durante 15 min.
6. Vuelva a suspender las cuentas mediante vórtice a máxima velocidad. Agregue 10 μL de la suspensión de perlas de estreptavidina, mezcle bien e incube en hielo durante 15 minutos.
7. Agregue 2,5 mL del tampón provisto en el kit de aislamiento de células T CD4⁺ y coloque el tubo en el imán durante 5 minutos.
8. Vierta con cuidado el líquido (células objetivo) del tubo en un nuevo tubo estéril, luego centrifugue a 4 °C, 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y conserve el pellet de celda.
9. Añada una cantidad suficiente de solución estéril de PBS para ajustar la concentración de células a 2 × 10⁶ células/ml y mantenga la suspensión en hielo para su uso posterior.
10. Utilice la citometría de flujo para evaluar la pureza de las células clasificadas (Figura suplementaria S1). Calcule la pureza de la célula como: (Número de células T CD4⁺ / Recuento total de células) × 100%. Confirme que la pureza es ≥90%¹⁶.

3. Transferencia adoptiva de linfocitos T CD4⁺

1. Anestesiar ratones C57BL/6 con 2%-3% de isoflurano, alcanzando una profundidad de anestesia en la que los ratones pierden toda la movilidad pero conservan la respiración espontánea normal.
2. Limpie suavemente el canto interno (esquina del ojo) del ratón con un hisopo de algodón estéril para eliminar las secreciones y el vello, exponiendo la vena.
3. Inmovilizar el ratón con la mano. Extraiga 200 μL de suspensión de células T CD4⁺ (2 × 10^5-5 × 10⁵ células por ratón) en una jeringa de 1 mL. Inserte la aguja en un ángulo de 10-15° en la vena cantal interna, asegurando una colocación precisa. Inyecte la suspensión celular lenta y uniformemente durante 10-15 s.
4. Después de retirar la aguja, presione suavemente el área interna del canto con un hisopo de algodón estéril durante 3-5 segundos para evitar el sangrado.
5. Coloque al ratón en una jaula tranquila, seca y limpia para monitorearlo hasta que recupere completamente la conciencia, con una respiración estable y sin comportamiento anormal (como espasmos o muerte súbita). Mueva el mouse a una jaula de alojamiento estándar después de confirmar el estado postoperatorio estable.
   NOTA: Dado que la vena cantal interna es pequeña, el manejo suave y la velocidad de infusión controlada son cruciales para evitar la ruptura de la vena o el bloqueo celular causado por una velocidad excesiva.
6. Registre los detalles de la infusión y etiquete los ratones modelo y del grupo de control (cuatro animales por grupo) para evitar confusiones en experimentos posteriores. Administre linfocitos T CD4⁺ a ratones modelo y deje a los ratones de control sin tratar. Asegúrese de que todos los ratones sean ratones receptores.

4. Estimulación e inducción del manán

1. Realizar la inducción de manano el día 4 (72 h después de la infusión de linfocitos T CD4⁺ ). Aplicar las mismas condiciones de inducción a todos los ratones experimentales y de control.
   1. Pesar el polvo de manano y disolverlo en PBS estéril hasta una concentración de 100 mg/mL.
   2. Sostenga el ratón correctamente para exponer su abdomen. Desinfecte la piel con alcohol al 75% e identifique el lugar de la inyección (~1 cm al lado de la línea media abdominal).
   3. Mezcle bien la solución de manano y extraiga el volumen adecuado (20-30 mg por ratón) en una jeringa de 1 mL. Inserte la aguja en un ángulo de 45° en la cavidad peritoneal e inyecte la solución lentamente para asegurar una distribución uniforme. Retire la aguja lentamente y presione suavemente el lugar de la inyección con un hisopo de algodón estéril durante unos segundos para evitar fugas o infecciones.
2. Coloque el ratón inyectado en una jaula tranquila y limpia, y vigile de cerca durante 5-10 minutos para asegurarse de que no haya fugas en el lugar de la inyección, distensión abdominal o respiración anormal.
3. Registre los detalles de la inyección de cada mouse en detalle.

5. Medidas

1. Observación del fenotipo clínico
   1. Puntuación de los síntomas de la artritis
      1. Realizar evaluaciones conjuntas cada 3 días después de la inducción de manano. Inspeccione todas las articulaciones de las extremidades anteriores y traseras, prestando especial atención a las articulaciones de la rodilla, el tobillo, la muñeca y los dedos de los pies. Puntuar la gravedad de la artritis utilizando criterios estándar (Tabla 1)¹⁷. Registre y compare las puntuaciones totales en cada punto de tiempo para evaluar la progresión de la artritis.
2. Registro de las características patológicas de los tejidos
   1. Después de un mes de inducción de manano, eutanasiar a los ratones bajo una campana de flujo laminar estéril utilizando asfixia con CO₂ (siguiendo las directrices del comité de ética), asegurar al ratón en una tabla de espuma y exponer las extremidades traseras. Incide la piel empezando por el tobillo y pela hacia arriba para exponer los músculos y las articulaciones. Identificar la articulación del tobillo (entre la tibia/peroné y el astrágalo) y las articulaciones metatarsofalángicas (entre los metatarsianos y las falanges proximales) y diseccionar estas articulaciones para su análisis histológico y preparar secciones de parafina.
   2. Fije los tejidos extirpados en formalina al 4% durante 72 h, luego transfiéralos al ácido etilendiaminotetraacético al 10% (EDTA, pH 7,4) durante 4 semanas de descalcificación para garantizar una descalcificación completa.
   3. Después de la descalcificación, lavar los tejidos con PBS para eliminar cualquier fijador residual y luego deshidratar los tejidos a través de una serie de etanol graduada (75%, 80%, 95%, 100%).
      NOTA: La formalina puede irritar los ojos, la piel y las vías respiratorias. Debe manipularse en una campana extractora.
   4. Incruste el tejido en parafina utilizando una máquina de inclusión de parafina. Utilice un micrótomo para seccionar el tejido incrustado en rodajas de 4 μm de grosor. Flotar las secciones en un baño de agua a 40 °C que contenga agua destilada.
   5. Transfiera y seque las secciones. Coloque las secciones en portaobjetos de vidrio. Sécalos durante la noche a temperatura ambiente (RT). Guarde los portaobjetos en RT para teñirlos.
   6. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
      1. Coloque los portaobjetos en un horno a 60 °C durante 2 h para eliminar la parafina.
      2. A temperatura ambiente, sumerja los portaobjetos en la siguiente secuencia durante 5 minutos cada uno: xileno → xileno → 100% etanol → 100% etanol → etanol al 95% → 80% a etanol → 75% a etanol. Enjuague con agua destilada durante 2 min.
      3. Teñir los portaobjetos secuencialmente en solución de hematoxilina durante 5 minutos, enjuagar con agua desionizada durante 2 minutos, luego tratar con amoníaco al 0,1% durante 1 min, enjuagar durante 3 x 2 min en agua desionizada, teñir con eosina durante 1 min y finalmente enjuagar con agua desionizada durante 2 min.
      4. Sumerja los portaobjetos durante 5 minutos cada uno en 80% de etanol → 95% de etanol → 100% de etanol → xileno → xileno.
      5. Secar al aire las guías de forma natural y montarlas con resina neutra.
   7. Safranina O-Fast Tinción verde
      1. Desparafina las secciones de parafina para regarlas y teñirlas con un kit de tinción de Van Gieson. Monte los portaobjetos con resina neutra después de la tinción y capture las imágenes bajo un microscopio (preparado en el paso 5.2.5).
3. Cambios en las células T y las citocinas
   1. Extirpar el bazo del ratón con herramientas quirúrgicas estériles.
      1. Extraiga el ARN total del tejido del bazo utilizando un kit de extracción de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuantifique la concentración y la pureza del ARN con un espectrofotómetro y asegúrese de que la relación A260/A280 esté entre 1,8 y 2,0.
      2. Sintetice ADNc a partir del ARN extraído utilizando un kit de transcripción inversa. Siga el protocolo del fabricante para la configuración de la reacción y las condiciones de ciclo. Almacene el ADNc a -20 °C para su posterior análisis de qPCR.
      3. Realizar qPCR: La medición de los niveles relativos de expresión de ARNm de Tbx21, Gata3, Il-17 y Foxp3 en el tejido del bazo se midió utilizando qPCR basada en SYBR Green en reacciones de 10 μL que contienen: 5 μL de 2 mezclas maestras SYBR Green, 0,2 μL de cebadores directos e inversos (10 μM; secuencias en la Tabla 2), 0,5-1 μL de ADNc (50-100 ng/μL), y agua libre de nucleasas a volumen. Utilice las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s, con análisis de la curva de fusión (65-95 °C). Normalice los niveles de expresión a Gapdh utilizando el método 2^(-ΔΔCt).
   2. Aislamiento sérico y análisis de matriz de bolas citométricas (CBA)
      1. Recoja sangre del ratón utilizando el método de recolección de sangre orbital por enucleación, transfiera la sangre a un tubo de recolección recubierto de anticoagulante y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Centrifugar la sangre coagulada a 4 °C, 1.000 × g durante 15 min, recoger cuidadosamente el sobrenadante (suero) y almacenarlo a -80 °C hasta el análisis.
      2. Determine los niveles de expresión de IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α e IFN-γ en el suero utilizando un kit de CBA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

Puntuación clínica de la hinchazón articular y la tasa de incidencia en ratones
La Figura 1 muestra la puntuación clínica de la inflamación articular y la tasa de incidencia en ratones modelo. Los resultados indican que todos los ratones del grupo modelo desarrollaron la enfermedad (n = 4), con una tasa de incidencia del 100%. Las puntuaciones en el grupo modelo aumentaron significativamente, mostraron un breve alivio en la segunda semana y, posteriormente, aumentaron durante un período de 6 semanas.

Manifestación de hinchazón articular en ratones
Las articulaciones de los ratones del grupo modelo exhiben un engrosamiento e hinchazón significativos, con una hinchazón y engrosamiento notables también observados en las extremidades anteriores y traseras (Figura 2).

Resultados patológicos de las articulaciones del tobillo del ratón
Los resultados anatomopatológicos indican que, en comparación con el grupo control, los ratones del grupo modelo muestran un engrosamiento significativo de la membrana sinovial en las articulaciones del tobillo, discontinuidad en el hueso y una marcada agregación de células inflamatorias (Figura 3, Figura 4 y Figura 5).

Factores inflamatorios séricos relacionados con las células T
En comparación con el grupo de control, los ratones del grupo modelo mostraron aumentos significativos en los niveles séricos de IL-10 (7,51 frente a 2,15 pg/mL), TNF (78,83 frente a 13,11 pg/mL), IL-17 (101,6 frente a 12,64 pg/mL) e IFN-γ (5,15 frente a 1,90 pg/mL) (p < 0,05). La IL-6 también aumentó significativamente en comparación con el grupo control (15,59 vs 6,27 pg/mL) (p = 0,05, Figura 6).

Cambios en los subconjuntos de células T Th1/2/17 y Tregs en el bazo
Se midieron los niveles de expresión de ARNm de Tbx21 (Th1), Gata3 (Th2), Il-17 (Th17) y Foxp3 (Tregs) para evaluar los cambios en los subconjuntos de células T en el bazo. Estos genes codifican factores de transcripción clave y citocinas que definen la diferenciación y la función de sus respectivos subconjuntos de células T. En comparación con el grupo de control, los ratones del grupo modelo mostraron un aumento significativo de la expresión de ARNm de Tbx21 (1,68 frente a 0,61) e Il-17 (26,30 frente a 0,75) en el bazo (p < 0,05) en relación con el gen de referencia Gapdh.

Figura 1: Puntuación clínica de la hinchazón articular. (A) Ratones del grupo modelo; (B) Incidencia acumulada en ratones del grupo modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Manifestaciones de hinchazón articular en ratones control y modelo (n = 4). (A-C) Imágenes representativas de las puntuaciones de hinchazón de las patas y las articulaciones (0,2,4) en los grupos de ratones control y modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Cambios histológicos en las articulaciones del tobillo de ratones del grupo control y del grupo modelo observados con tinción de hematoxilina-eosina. (A) Articulación del tobillo del ratón control; (B) Discontinuidad en el hueso de la articulación del tobillo del ratón del grupo modelo; (C) Proliferación sinovial en la articulación del tobillo del ratón del grupo modelo. Barras de escala = 50 μm (primera columna), 100 μm (segunda y tercera columnas). Las imágenes de las Fig. 3B y 3C son del mismo ratón, mostrando diferentes fenotipos patológicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diferencias en el grosor sinovial de las articulaciones del tobillo entre el grupo control y los ratones del grupo modelo (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Cambios histológicos en las articulaciones del tobillo de ratones del grupo de control y del grupo modelo observados con la tinción de Safranina O-Fast Green. (A) Articulación del tobillo del ratón del grupo de control; (B) Proliferación sinovial en la articulación del tobillo del ratón del grupo modelo. Barras de escala = 50 μm (primera columna), 100 μm (segunda y tercera columnas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Cambios en los factores inflamatorios relacionados con las células T y subconjuntos en ratones de grupo de control y modelo. (A) Expresión de factores inflamatorios relacionados con las células T en el suero de ratones del grupo de control y modelo y (B) los cambios en los subconjuntos de células T Th1/2/17 y Tregs en el bazo. *p < 0,05, **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Puntuación	Hinchazón (rango 0-4)	Eritema (rango 0-2)
0	Ninguno	Ninguno
1	Cualquier dígito	leve
2	Pata	Extremo
3	Muñeca/tobillo
4	Extremidad entera

Tabla 1: Criterios de puntuación de la artritis. Para puntuar la artritis, cada extremidad se puntúa de acuerdo con la hinchazón y el eritema, con una puntuación de 0 a 6 asignada a cada extremidad. Las puntuaciones de las cuatro extremidades se suman para generar la puntuación total de artritis de cada ratón.

Secuencias de cebadores
Nombre de Oligo	Secuencia de 5' a 3'
TBX21-Adelante	AGCAAGGAGCGAATGTT
TBX21-Reverso	GGGTGGACATATAAGCGGTTC
Gata3-Delantero	CTCGGCCATTCGTACATGGAA
Gata3-Reversa	GGATACCTCTGCACCGTAGC
il-17A-Adelante	TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
il-17A-Reversa	CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3-Adelante	CCCTTGACCTCAAAACCAAG
Foxp3-Reversa	GTGTGACTGCATGACTAACTTTGA
Gapdh-Adelante	GGTTGTCTCCTGCGACTTCA
Gapdh-Reversa	TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC

Tabla 2: Lista de secuencias de cebadores.

Figura suplementaria S1: Estrategia de compuerta para la clasificación de células T CD4⁺ por citometría de flujo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El desarrollo de AR está estrechamente asociado con la infiltración anormal de células inmunitarias en el tejido sinovial, donde la activación desregulada de estas células inmunitarias conduce a la liberación de varias citocinas proinflamatorias, que contribuyen aún más al daño de las estructuras sinoviales y articulares^18,19. Varios modelos animales de AR han sido ampliamente evaluados, incluyendo el modelo CIA, el modelo K/BxN y ratones SKG 13,20,21. Si bien estos modelos replican con éxito los mecanismos inmunitarios y las manifestaciones clínicas de la AR, todos tienen limitaciones significativas. Por ejemplo, el modelo CIA en ratones C57BL/6 tiene una tasa de éxito más baja, un período de inicio más largo y está significativamente influenciado por las condiciones ambientales y experimentales, lo que lo hace menos práctico en ciertos entornos experimentales. Los ratones SKG representan un modelo de ratón con AR basado en una mutación del gen ZAP-70, que causa una anomalía abrupta en la señalización del receptor de células T (TCR) e induce artritis autoinmune²². Sin embargo, este modelo es caro y la reproducibilidad de los resultados experimentales se ve fácilmente afectada por las condiciones de inducción. La K/BxN es un modelo de artritis hereditaria desencadenado por la actividad cooperativa de las células T y B, que presenta una respuesta inmunitaria pronunciada²³. Sin embargo, la construcción de este modelo es costosa y su especificidad es limitada, lo que conduce a una respuesta inmunitaria limitada que no puede capturar por completo el proceso patológico multifacético de la AR humana. Por lo tanto, es de gran importancia desarrollar un modelo animal que pueda replicar las características patológicas clave de la AR, cumplir con varios requisitos experimentales y garantizar una alta reproducibilidad.

En este estudio, presentamos un método para establecer un modelo de AR a través de la transferencia adoptiva de células T CD4⁺ adaptativas de ratones SKG. La construcción de este modelo se basa en la selección de células T CD4⁺ de ratones SKG con un fondo C57/BL6 y la inducción de manano, un proceso que asegura el éxito del modelo. Es ampliamente conocido que los ratones SKG en un fondo BALB/c portan una mutación espontánea del gen ZAP70 (W163C), que causa una selección anormal de la señalización de TCR, lo que conduce a células T altamente autorreactivas²⁴. Esto da lugar a una activación excesiva de las células T y a la aparición de sinovitis y destrucción articular, imitando así los procesos patológicos clave de la AR, como la reparación sinovial y la activación de las células inmunitarias^25,26. Las características clínicas de los ratones SKG se parecen mucho a las de los pacientes humanos con AR.

Para introducir esta mutación en el fondo C57BL/6, empleamos la tecnología CRISPR/Cas9 para generar con éxito un modelo de ratón SKG de fondo C57BL/6 portador de la mutación ZAP70 (W163C). CRISPR/Cas9 ofrece una alta precisión y eficiencia, permitiendo la introducción dirigida de la mutación deseada mientras se mantiene una baja tasa de inserción fuera del objetivo o modificaciones genéticas no deseadas asociadas con los métodos tradicionales de inducción aleatoria, asegurando así la estabilidad y singularidad del modelo^27,28. Más importante aún, esta técnica también reduce significativamente el tiempo requerido para la construcción del modelo, mejorando tanto la capacidad de control como la eficiencia del desarrollo del modelo. Con este modelo, podemos replicar con precisión la sinovitis mediada por células T y la destrucción articular de la AR contra un fondo C57BL/6. En comparación con el fondo BALB/C en ratones SKG tradicionales, los ratones modelo con un fondo C57BL/6 tienen una aplicabilidad más amplia en la investigación inmunológica y pueden combinarse más fácilmente con otros modelos transgénicos (por ejemplo, Rag1^-/- o IL17^-/-). Esto los hace adecuados para investigar el papel de la mutación ZAP70 en la AR y otras enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico o la esclerosis múltiple.

Sobre la base del papel fundamental^29,30 de las células T CD4⁺ en la activación de la AR, las seleccionamos como mediadores clave. Las células T son los principales impulsores de las respuestas inmunitarias en la AR y pueden inducir directamente daño sinovial mediante la activación de los subconjuntos efectores Th1/Th17³¹, dependiendo de factores inflamatorios como IL-6, IL-17 y TNF-α^32,33. Como mediadores fundamentales de la regulación inmunitaria, los linfocitos T CD4⁺ secretan citocinas proinflamatorias, que desencadenan y mantienen la cascada inflamatoria, lo que conduce a la proliferación sinovial y al daño articular, promoviendo así directamente la progresión patológica de la AR. Son fundamentales para ayudar a las células B en la producción de anticuerpos específicos (por ejemplo, ACPA)³⁴. Mientras tanto, la característica histopatológica típica de la membrana sinovial de la AR es la agregación de células T CD4⁺. Ciertos genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II, especialmente los "epítopos compartidos" relacionados con el isotipo de antígeno-DR de leucocitos humanos (HLA-DR), se consideran estrechamente relacionados con la patogénesis de la AR³⁵. Además, la estrategia de bloqueo de la coestimulación de las células T con el antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4)-Ig ha demostrado una eficacia clínica significativa en la AR³⁶. Además, la inducción de manano sirve como un potente activador para el modelo, promoviendo la activación de componentes inmunes innatos como las células dendríticas y los macrófagos³⁷. Este paso facilita aún más la activación de las células T CD4⁺ y las respuestas inmunitarias, aumentando significativamente el ataque del sistema inmunitario a los tejidos propios, simulando así las características patológicas de la desregulación inmunitaria y el daño sinovial en la AR.

Después de completar la inducción del modelo, realizamos una verificación sistemática del grupo modelo utilizando múltiples parámetros, incluida la puntuación clínica de la hinchazón articular, la validación patológica (observando la patología tisular de la sinovitis y las características de la destrucción articular) y la validación inmunológica (expresión de células Th1/2/17 y Treg en suero y bazo). Los resultados mostraron que nuestro modelo replicó con éxito la sinovitis mediada por linfocitos T y la destrucción articular en la AR, induciendo activación inmune característica y cambios patológicos sinoviales consistentes con los principales mecanismos fisiopatológicos de la AR, con una tasa de prevalencia del 100%. Cabe destacar que en nuestro modelo, la puntuación clínica de la inflamación de las articulaciones de los ratones alcanza su punto máximo a la 1 semana, muestra una marcada reducción en la segunda semana y luego vuelve a aumentar gradualmente en etapas posteriores, lo que no está del todo en línea con el curso típico de la enfermedad observado en los modelos animales convencionales de artritis³⁸. Esto puede deberse a que, 1 semana después de la inducción, el sistema inmunitario de los ratones modelo se encuentra en una fase inicial intensamente activada por la inyección de manano, lo que provoca un pico de inflamación articular. En la segunda semana, la regulación inmunitaria y los mecanismos de autorrecuperación conducen a un alivio temporal de los síntomas clínicos. A medida que la enfermedad progresa, la tolerancia inmunitaria disminuye gradualmente y la respuesta inmunitaria se vuelve a intensificar, manifestándose por un empeoramiento gradual de la afección en etapas posteriores.

Aunque este modelo es relativamente simple en comparación con otros modelos, todavía hay varios puntos clave que deben abordarse durante el proceso de modelado. En primer lugar, la actividad y la pureza de las células T CD4⁺ de ratones SKG forman la base del éxito del modelo. La pureza de las células debe superar el 90% para garantizar la consistencia y fiabilidad de los resultados experimentales. En segundo lugar, la velocidad de inyección en la vena cantal medial debe controlarse cuidadosamente para evitar la ruptura de la vena por inyectar demasiado rápido o la fuga de células por inyectar demasiado lentamente. Además, la selección de la dosis celular es fundamental. Una dosis demasiado baja puede provocar el fracaso del modelo, mientras que una dosis demasiado alta puede desencadenar respuestas inflamatorias inespecíficas. Por lo tanto, durante el proceso de modelado, se debe monitorear de cerca la condición general de los ratones y cualquier síntoma anormal debe registrarse de inmediato para garantizar el buen progreso del experimento y la validez científica de los datos.

En comparación con los modelos convencionales, este modelo tiene un período de establecimiento más corto, logra una tasa de incidencia más alta en ratones C57BL/6 y sigue siendo relativamente rentable y fácil de operar. La adopción de la transferencia de células T CD4⁺ autorreactivas reproduce con precisión las respuestas inmunitarias mediadas por células T y captura las características patológicas clave de la AR, como la hinchazón y el daño de las articulaciones. Además, sus manifestaciones clínicas se alinean bien con las de la AR humana, ofreciendo un reflejo más auténtico de los procesos clínicos y patológicos de la AR. Además, la combinación de la infusión de la vena cantal medial y la inducción de manano mejora aún más la controlabilidad y la estabilidad experimental del modelo, haciéndolo altamente reproducible y ofreciendo un excelente control experimental. Por supuesto, este modelo todavía tiene limitaciones. Se centra principalmente en las respuestas inmunitarias impulsadas por las células T; la simulación de las funciones colaborativas de las respuestas de anticuerpos mediadas por células B y otras células inmunitarias (como las células asesinas naturales (NK) y las células Treg) es insuficiente, lo que dificulta la representación completa de los mecanismos patológicos multicelulares de la AR. No obstante, este modelo de ratón con AR sigue siendo un modelo animal estable y fiable, lo que proporciona a los investigadores una mejor plataforma para simular las respuestas inmunitarias mediadas por células T y las principales características patológicas de la AR. Este modelo permite a los investigadores profundizar en los mecanismos inmunitarios y la progresión patológica de la AR, proporcionando importantes pruebas experimentales y herramientas para el desarrollo de nuevas terapias, especialmente en la comprensión de la desregulación inmunitaria impulsada por las células T y la identificación de dianas terapéuticas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Yeasen	10208ES60	Preparing agarose gel for use in DNA electrophoresis experiments
Anhydrous ethanol	Shanghai HuShi Laboratory Instruments Co., Ltd.	100009218	Dehydrating and fixative agent
ZAP 70 primers	Tsingke		Primers used for detecting ZAP70 gene expression, commonly used in PCR experiments for genotyping mice
0.5 M EDTA solution (pH = 7.4)	Biosharp	R00521	Used for decalcification to ensure the quality of tissue sections and staining for calcium-containing tissues, while maintaining the structural integrity of the tissue
1.5 mL enzyme-free ep tubes	LABSELECT	MCT-001-150-S	Used for a variety of experiments such as sample storage, centrifugal separation, etc
2x Q3 SYBR qPCR Master Mix (Universal)	ToloBio	22204	Used for performing highly specific and highly sensitive qPCR reactions.
2x Magic Green Taq SuperMix	TOLOBIO	21502-04	Buffer solution for pre-electrophoresis
4% Formaldehyde (paraformaldehyde) solution	Biosharp	BL539A	Used as a fixative to preserve tissue structure and cellular morphology, providing stable and well-preserved samples for subsequent staining steps
Animal tissue/cell total RNA isolation kit	Servicebio	MPC2409122	Extraction of total RNA from animal tissues/cells
BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit	BD Biosciences	560485	Measure the expression of Th1/2/17 cytokines in mouse serum.
Cell Culture dish	LABSELECT	12211	A container for cell fluid from the spleen and lymph nodes
Dimethylbenzene	China National Pharmaceutical Group Chemical Reagents Co., Ltd.	10023418	Used as a deparaffinizing and clearing agent
Easyfive six-port cell counting chamber	CytoEasy	N3EF110	Used for cell counting
Enhanced Safranin O-Fast Green staining solution for cartilage.	Solarbio	G1371	Stain cartilage and bone tissues to observe pathological changes in the joint area.
Glass slide	CITOTEST	188105	Basic support for tissue slicing
Hematoxylin staining solution	Servicebio	G1005-1	Dying
Hematoxylin staining solution	Servicebio	G1001	Dying
Low-speed refrigerated centrifuge	Cence	F14300021010004	It is used for centrifugation and precipitation
Mannan	Sigma	m7504	Activator for the model.Dissolve in sterile PBS at 2 mg/mL, mix thoroughly, and filter through a 0.22 μm membrane to eliminate any particles or possible sources of contamination.
MojoSort Magnet	Biolengend	480019	Used for isolating and purifying CD4+ T cells from spleen, lymph nodes of mice
MojoSort Mouse CD4 T Cell Isolation Kit	Biolengend	480033	Used for isolating and purifying CD4+ T cells from spleen, lymph nodes of mice . Use a negative selection method that directly binds to the CD4 molecule to isolate CD4+ T cells, preserving the integrity of surface antigens without affecting CD4 molecule functionality, making it suitable for CD4+ T cell infusion experiments.
Nano-300	ALLSHENG	AS-11020-00	Accurate detection of nucleic acids, proteins, and cellular solutions
Neutral resin mounting agent	Biosharp	BL704A	Fix and preserve stained tissue sections
Paraffin microtome	KEDEE	KD-3389	Used for paraffin sections
Phosphate-buffered saline (PBS)	Pricella	WHB824P281	Used as a buffer solvent or cleaning agent,
Sterile cell filter (70 µm)	Biosharp	BS-70-CS	Remove large impurities or aggregated cell clusters from the cell suspension to ensure sample purity and cell uniformity
Sterile syringe (1 mL)	Lingyang Medical Apparatus	20241020	Injection into the inner canthal vein
Tabletop high-speed microrefrigerated centrifuge	SCILOGEX	S1010E	Used for centrifugation and precipitation
TEA Buffer (50x)	Yeasen	60116ES76	Stabilizes pH, helps protect and preserve molecules like DNA and RNA, used in electrophoresis experiments
ToloScript All-in-one RT EasyMix for qPCR	ToloBio	22107	Used to convert RNA templates into cDNA, facilitating subsequent gene expression analysis, qPCR, and other molecular biology experiments.
Transefer Pipettes	BIOFIL	240515-133-A	Used for transferring solutions
Trypan blue dye solution	Biosharp	7009529	Commonly used for cell viability assays, helps differentiate live cells from dead cells