La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

Resumen

Una sola célula de electroporación (SCE) es una técnica especializada que permite la entrega de ADN u otras macromoléculas en las células individuales en el tejido intacto, incluso en los preparativos vivo. Aquí detallamos el procedimiento para la SCE de un colorante fluorescente o de ADN plásmido en las neuronas en el cerebro intacto de los renacuajos Xenopus laevis.

Resumen

Una sola célula de electroporación (SCE) es una técnica especializada que permite la entrega de ADN u otras macromoléculas en las células individuales en el tejido intacto, incluso en los preparativos vivo. La ventaja de esta técnica es que la manipulación experimental se puede realizar en las células individuales, dejando el tejido circundante sin alterar, por lo tanto distinguir células autónomas efectos de los resultantes de los tratamientos globales. Cuando se combina con avanzadas técnicas de imagen en vivo, SCE de marcadores fluorescentes permite la visualización directa de la morfología celular, el crecimiento celular, y eventos intracelulares en escalas de tiempo que van desde segundos a días. Si bien esta técnica se utiliza en una variedad de preparaciones en vivo y ex vivo, hemos optimizado esta técnica para su uso en los renacuajos Xenopus laevis. En este artículo de vídeo, se detalla el procedimiento para la SCE de un colorante fluorescente o de ADN plásmido en las neuronas en el cerebro intacto de los albinos renacuajos Xenopus. También se discuten los métodos para optimizar el rendimiento, y mostrar ejemplos de vida de dos fotones de imágenes de fluorescencia de las neuronas marcados con fluorescencia por SCE.

Protocolo

Instalación del equipo:

1. Los equipos eléctricos requeridos para esta técnica son un estimulador, un osciloscopio y un soporte para micropipeta equipado con un hilo de plata que se inserta en la micropipeta. Por lo general el uso de un axón instrumentos Axoporator 800A estimulador, sin embargo otros estimuladores comunes, tales como los instrumentos de hierba SD9 estimuladores también son adecuados para una sola célula de electroporación. El estimulador se conecta a la headstage, que conecta con el electrodo de hilo de plata que se coloca dentro de la micropipeta de vidrio que contiene una solución interna llevar a cabo. El otro cable del estimulador se conecta a la entrada del osciloscopio, que también recibe información desde la base externa de renacuajo. La toma de tierra externa renacuajo es más que un hilo de plata que permanece en contacto con el renacuajo electrotonic durante la electroporación. El circuito se completa una vez que la micropipeta se pone en contacto con el renacuajo.
   
   
2. Electroporación sola célula requiere un microscopio con una buena distancia de trabajo (por lo menos 5 cm), ya que esto da margen de maniobra y permite que la micropipeta para ser llevado en un ángulo de unos 30-45 grados.

Fabricación de pipetas:

Preparación de pipetas adecuada es un paso crítico en este protocolo. La dificultad radica en el equilibrio de una punta estrecha (menos de 1μm de diámetro) con uno que no se rompa fácilmente al perforar el tejido. También hemos encontrado que las puntas con un ángulo de inclinación de más de 10 grados es preferible.

1. Prepare una micropipeta de vidrio tirado con un diámetro de la punta de menos de 1μm, y un ángulo de inclinación de la punta superior a 10 grados.
   1. Vidrio de borosilicato con un filamento interno con un diámetro exterior de 1,5 mm de diámetro interior de 0,75 mm y es muy adecuado para este propósito.
      1. El vidrio relativamente gruesa proporciona un grado de rigidez de la punta.
      2. El filamento interno es importante en la elaboración de nuevo lleno de líquido hacia la punta de la micropipeta.
2. Fabricación de consejos adecuados a menudo se requieren varias modificaciones sobre la base de los resultados observados. Diferentes tejidos puede requerir una punta con una forma ligeramente diferente o diámetro de la punta.

Una sola célula de electroporación protocolo:

Para los nuevos usuarios, es recomendable comenzar con los tintes fluorescentes dextrano, ya que, a diferencia de las proteínas codificadas genéticamente fluorescente, que se puede observar inmediatamente en epifluorescencia. El uso de colorantes fluorescentes permite al usuario ver directamente la ubicación de la punta de la micropipeta dentro del tejido, y sobre la electroporación ofrece información instantánea sobre si el equipo ha sido configurado correctamente y si la punta de la micropipeta es apropiado.

1. Rellene micropipeta con una solución de compuesto que se electroporated ya sea mediante el uso de una jeringa de carga o de back-llenado.
   1. Si se utiliza el ADN plásmido, que las muestras están libres de endotoxinas, y en una concentración entre 1-2μg/ml, preparado en agua.
   2. La concentración de los tintes fluorescentes dextrano debe ser determinada empíricamente. A menudo se utilizan tintes fluorescentes diluido en agua a aproximadamente 300μM.
   3. Por lo general, los volúmenes de 0,5-1μl son suficientes.
   4. Antes de cargar, en pocas palabras centrífuga soluciones a alta velocidad para reducir la cantidad de restos de partículas arrastrados a la micropipeta, lo que puede conducir a la obstrucción.
   5. Las burbujas de aire dentro de la punta a menudo afectan el flujo de corriente y deben ser desalojados por la micropipeta agitando vigorosamente antes de montar en el headstage.
2. Inserte micropipeta en el soporte o headstage montado en un micromanipulador de 3 ejes. Asegúrese de que el electrodo de alambre de plata se inserta en micropipeta, y está en contacto con electrotonic la solución interna.
3. Anestesiar a los renacuajos por inmersión en un 0,02% MS-222 (3-amino-éster etílico del ácido), preparado en el medio de la crianza de renacuajos (solución de Steinberg, pH 7,4).
   1. Normalmente se usan etapa 44-48 albino renacuajos Xenopus laevis en nuestros experimentos.
   2. Los renacuajos son por lo general completamente anestesiado después de aproximadamente 5 minutos.
   3. Varios renacuajos se puede anestesiar al mismo tiempo para reducir el tiempo de espera, sin embargo, evitar la exposición a MS-222 para períodos más allá de una hora.
4. La transferencia de un renacuajo anestesiados solo a la cámara de electroporación utilizando una micropipeta de transferencia de plástico.
   1. La cámara de electroporación se puede hacer fácilmente en casa por tallar una cavidad en forma de renacuajo en una pequeña Sylgard ® bloque de silicona, y la inserción de un cable de tierra de plata en la cavidad de tal manera que se pondrá en contacto con electrotonic el renacuajo en la cámara.
5. Lado la posición de renacuajo dorsal usando un pincel humedecido.
6. Baje la micropipeta hasta que esté en contacto con la piel, justo al lado de la región de interés.
   1. Orientación regiones con cuerpos celulares densamente aumentará en gran medida las posibilidades de éxito de la electroporación.Por lo general el objetivo de techo óptico renacuajo.
   2. Traiga la micropipeta en un ángulo de 30 a 45 grados. Menos profundas que las trayectorias de perforación de la piel más difícil, mientras que los ángulos más pronunciada a menudo obstruyen una de vista.
7. La reducción continua de la micropipeta inicialmente hoyuelo en la piel, para después pasar por dentro del tejido subyacente.
   1. Las células superficiales son los preferidos para imágenes in vivo, y puede ser objetivo de asegurar que la punta de la micropipeta se reduce poco a poco en formación de hoyuelos en la piel.
8. Uno debe vigilar constantemente la resistencia micropipeta una vez colocado en el tejido. Si se utiliza un Axoporator 800A (Axon Instruments), las resistencias de aproximadamente 10 40MΩ son óptimas. La resistencia es un buen indicador de si el diámetro de la punta es apropiada para una sola célula de electroporación.
   1. Altas resistencias micropipeta (> 100MΩ) son indicativos de consejos obstruido o micropipetas con puntas que son demasiado estrechas.
   2. Bajas resistencias micropipeta (<10MΩ) son indicativos de un diámetro de la punta que es demasiado grande, a menudo el resultado de una punta rota.
   3. Si se utiliza un estimulador que no proporciona una medida de resistencia directa, la resistencia micropipeta indirectamente se puede medir observando la amplitud de los pulsos de tensión medida por el osciloscopio (véase más adelante).
9. Aplicar tren de tensión.
   1. De ADN plásmido, trenes de pulsos encontrado para ser más eficaces consisten en negativo pulsos de onda cuadrada de 1 ms de duración, entregado a 300 Hz con una duración de tren de pulsos de 500 ms.
      1. La tensión del pulso se determina empíricamente de tal manera que la amplitud de los pulsos medido en el osciloscopio está entre 0,75 y 1.5μA.
   2. Para lámparas fluorescentes tintes dextrano, positivos impulsos de onda cuadrada de la duración de 300μs se entregan con una frecuencia de 300 Hz con una duración de tren de pulsos de 10 ms.
      1. Al igual que con el protocolo de ADN, la tensión del pulso se determina empíricamente de tal manera que la amplitud de los impulsos medidos en el osciloscopio es de entre 0,75 y 1.5μA.
      2. Ajustes adicionales a los parámetros del estímulo puede hacerse con base en la observación de los resultados de la electroporación en epifluorescencia.
         1. Si las células electroporated aparecer tenue, los parámetros del pulso debe aumentar gradualmente hasta que las células aparecen más brillantes.
         2. Por otro lado, si los grupos de células están etiquetados, los parámetros del pulso debe ser reducido hasta que las células individuales están etiquetados.
10. Retraer micropipeta, vuelva a insertar en un sitio diferente dentro del tejido, y aplicar tren de tensión.
    1. Para mejorar el rendimiento, por lo general electroporar varios sitios con cada hemisferio del renacuajo Tectum óptico con un espacio suficiente para asegurar que las células marcadas no se superpongan.
11. Transferir el renacuajo electroporated en un recipiente con una solución de la crianza de Steinberg.
    1. Renacuajos rápido se recuperará de la anestesia en pocos minutos.
12. La micropipeta mismo puede ser utilizado para numerosos renacuajos. Es importante observar constantemente la amplitud de los pulsos observados en el osciloscopio.
    1. Si la amplitud del pulso sigue siendo baja después de aumentar significativamente la intensidad del pulso este es probablemente el resultado de la punta está obstruida, a menudo se ve cuando electroporating muchos renacuajos en una sola sesión.
       1. Un método para desalojar a una obstrucción punta de menores es la aplicación de un pulso positivo solo después de insertar la micropipeta en el tejido.
       2. Si la obstrucción no puede ser desplazado, o la obstrucción a menudo se repite, reemplace la micropipeta.
    2. Si la amplitud del pulso sigue siendo muy grande después de disminuir significativamente los parámetros de pulso, esto es una señal de que la punta se ha roto y necesita ser reemplazado.

La detección de células con éxito electroporated:

1. Después de la electroporación, los renacuajos son examinados para detectar células marcadas con un microscopio de epifluorescencia vertical.
2. En el caso de los tintes fluorescentes, los renacuajos pueden ser examinados después de tan poco como 30 minutos después de la electroporación.
   1. Hemos encontrado, sin embargo, que los intervalos más largos están asociados con menores niveles de fluorescencia de fondo.
3. Para genéticamente codificados proteínas fluorescentes, la detección se realiza normalmente al menos 12 horas después de la electroporación.
   1. Las células que expresan proteínas fluorescentes seguirá cada vez más brillante con el tiempo, por lo tanto, las células oscuras pueden ser re-examinados después de un intervalo adicional de 12 a 24 horas.
4. Los renacuajos son anestesiados como se describió anteriormente, en una cámara Sylgard ® y cubreobjetos. Renacuajos individuales se examinan con epifluorescencia.
   1. Tenga en cuenta que la exposición excesiva a la luz de epifluorescencia dará lugar a la fototoxicidad que pueden matar a la célula marcada. Por lo tanto, minimizar la cantidad de tiempo que las células están expuestas a la luz fluorescente.
5. Volver renacuajos a un recipiente con una solución de la crianza de Steinberg.

Discusión

Una sola célula de electroporación (SCE) es una poderosa herramienta para determinar la función del gen y la realización de la manipulación genética dirigida. La transparencia de los renacuajos albinos y la accesibilidad del cerebro hacen que este sistema modelo ideal para la visualización de crecimiento neuronal y eventos intracelulares en un organismo vivo. SCE permite la visualización del crecimiento de una sola neurona, y para llevar a cabo por células autónomas manipulaciones dentro de un cerebro de otra manera inalterada. Si...