La construcción y la implantación de un Sistema de microinfusión para la entrega sostenida de agentes neuroactivos.

Resumen

Como la investigación neurociencia se vuelve más sofisticada, la investigación de las estructuras del cerebro y los circuitos requiere mejorar los niveles de precisión y alta resolución. Hemos desarrollado un método para la preparación e implantación de un sistema de infusión crónica en el cerebro utiliza una micro cánula de borosilicato con un diámetro de la punta de 50 micras.

Resumen

Protocolos experimentales utilizadas para la infusión crónica de agentes neuroactivos dentro de las regiones del cerebro, generalmente utilizan un sistema de mini-bomba osmótica. Los agentes son generalmente entregados a través de una cánula de acero inoxidable con un diámetro de 0,30 mm o mayor. Los sistemas que utilizan una cánula de este calibre puede imponer un traumatismo en el área de interés que resulta en daños arquitectónicos, comprometiendo la integridad estructural y el funcionamiento normal. Como la investigación neurociencia se vuelve más sofisticada, la investigación de las estructuras del cerebro y los circuitos requiere mejorar los niveles de precisión y alta resolución. Hemos desarrollado un método para la preparación e implantación de un sistema de infusión crónica en el cerebro utiliza una micro cánula de borosilicato con un diámetro de la punta de 50 micras. Esta técnica reduce el daño al medio ambiente local y disminuye gliosis reactiva en el sitio de la infusión. La configuración del sistema microinfusión también es capaz de adaptarse a la superficie del cráneo del animal, evitando la necesidad de grandes pedestales del cráneo, lo que facilita el cierre de la incisión del cuero cabelludo y la reducción del riesgo de infección. Nos demuestran una entrega confiable sostenido de un tinte que tiene un peso molecular representante mediante un modelo in vitro e in vivo en ratas.

Protocolo

Introducción

Infusión directa de los agentes neuroactivos permite a las regiones específicas del cerebro para ser estudiado sin pasar por la barrera hematoencefálica. Las aplicaciones de este enfoque de la neurociencia son diversos e incluyen la alteración del nivel de actividad cerebral en las subregiones discretos (Berretta et al, 2004;. Gliddon et al, 2005;.. Kim et al, 2000), investigar las acciones de agentes psicotrópicos ( Clinton et al, 2006;.. Di Benedetto et al, 2004), proporcionando modelos de control de la inflamación del cerebro (Hauss-Wegrzyniak et al, 1998;. Marchalant et al, 2007;.. Rosi et al, 2004), estudiando los mecanismos de la adicción (Kim et al, 2005;. Lockman et al, 2005;. Zhang et al, 2006.), y permitiendo a largo plazo la administración de factores tróficos (Naert et al, 2006;.. Radecki et al, 2005; Takahashi et al., 2006).

Métodos estándar para la entrega de crónica de los agentes a menudo utilizan una bomba de mini-osmótica (por ejemplo, bombas Alzet osmótica, Cupertino, CA) cargado con un agente neuroactivos, que se entrega en el cerebro a través de una cánula de acero inoxidable con un diámetro que puede oscilar entre 0,25 mm (Williams et al, 1987). a 0,5 mm, pero lo más frecuente es de aproximadamente 0,3 mm (plásticos One, Roanoke, VA; ver Fig. 6A). Mientras que las cánulas de entrega de este tamaño puede ser útil para muchas aplicaciones en las que los altos niveles de precisión no son necesarias y un traumatismo en el microambiente no es una preocupación importante, estas cánulas son óptimas para la entrega de los agentes a los sitios pequeños y delicados en los que la cánula se puede comparar en el tamaño (o mayor que) la estructura objetivo en sí, o cuando la función no debe verse comprometida por la lesión traumática.

Se presenta aquí un método para la preparación e implantación de un sistema de infusión crónica para la entrega de los agentes neuroactivos en el cerebro utiliza un "micro cánula" con un diámetro de la punta mucho más reducido. Esta técnica permite subestructuras pequeñas para ser objetivo y reduce el trauma a la del área de interés. El presente procedimiento es, pues, enseña como una alternativa a los métodos convencionales para los investigadores que desean minimizar la interrupción de la región del cerebro se está investigando.

Materiales y métodos

Los animales y el diseño

Dieciocho adultos (400-450 g) ratas Sprague-Dawley fueron utilizados para demostrar el procedimiento y comprobar el funcionamiento del presente procedimiento. Doce animales fueron implantados con sistemas microinfusión y contribuyó a la evaluación del curso temporal de la función sostenida a lo largo de 4 días. Seis animales fueron utilizados para comparar el nivel de trauma y gliosis reactiva cinco días después de la implantación de un estándar de 28 o bien la entrega ga cánula (N = 3) o una micro cánula (N = 3) unida a una solución salina mini-osmótica de la bomba. Los animales fueron alojados en jaulas de plástico transparente, y se mantiene en un 12 horas de luz / oscuridad horario, con comida y agua ad libitum. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de McLean Hospital de Animales institucional y el empleo, en cumplimiento de las pautas federales y locales para el uso experimental de animales.

Microinfusión montaje del sistema

La Figura 1 ilustra los componentes y el montaje del sistema de microinfusión. Se recomienda la construcción y la implantación del sistema utilizando una técnica estéril. Además, con el fin de prevenir la introducción de aire en el sistema, que se monta mientras está sumergido en un baño de solución salina. Para las pruebas actuales, bombas mini-osmóticas (MOP) estaban empleados (Alzet, modelo # 1002, Cupertino, CA) con una duración de 14 días, caudal de 0,25 l / h, y una capacidad de llenado de l 98,6. Sin embargo, dado que las tasas de exceso de flujo puede diluvio pequeñas áreas de interés en el cerebro y causar daños estructurales, el caudal de estos estudios se redujo a 0.125 l / h por una capa de la mitad de la RP con parafina según las instrucciones del fabricante. Para la evaluación de trauma local, MOP se llena con solución salina estéril. Para la evaluación de la función de sostenido de los sistemas microinfusión, Fast Green (1% en solución salina, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) fue elegida como una solución de prueba, debido a su baja toxicidad, su capacidad de difundir en el tejido cerebral viable, y debido a que tiene un peso molecular (808.84) en el extremo superior del rango de "moléculas pequeñas" (<1,000) que son de interés para la infusión crónica (por ejemplo, muscimol, picrotoxina, fluoxetina, etc.)

Figura 1: Asambleablea del sistema microinfusión. (A) Los componentes del sistema que entren en sus posiciones relativas para el montaje. Nota de la brida de la tubería modulater flujo se ha roto. Se recomienda el alambre de la alineación se protegen de la misma antes de la implantación (ver texto). (B) los artículos del sistema microinfusión previo a la conexión de cable de la alineación y la implantación.

Microcánula preparación

El microcánula se puede formar con un extractor de electrodos estándar horizontal o vertical (Stoelting Co., Wood Dale, IL) con los ajustes para la producción de un electrodo de vidrio con una caña larga, suavemente disminuyendo (Fig. 2A). Tubos de borosilicato es adecuado para este fin (parte 1B100F-6, 1,0 mm, 6 en: Instrumentos del Mundo de precisión, Inc., Sarasota, FL), ya que tiene un punto de fusión relativamente bajo, lo que permite la flexión posterior con el calor concentrado. La porción más distal de la micro cánula recta se puede cortar con tijeras de disección o rotura controlada se pueden hacer con microforceps (Instrumentos World Precision, Inc., Sarasota, FL) para dar el diámetro deseado extremo final (50 micras para las manifestaciones actuales ), y un micrómetro de platina del microscopio es muy útil para orientar y confirmar el diámetro deseado. La punta de corte se puede calentarse brevemente, o "pulido al fuego", para eliminar los bordes ásperos o filosos. El serpentín del extractor de electrodos o un mechero de Bunsen se utiliza para imponer un ángulo a la derecha en la micro cánula a una distancia predeterminada desde la punta de la micro cánula (Fig. 2B) mediante la colocación de los tubos de borosilicato en el serpentín de calefacción (o una llama de mechero Bunsen ) y la aplicación de fuerza suave en la parte distal con una pinza en el tubo se calienta. La longitud predeterminada de la micro cánula distal al ángulo derecho impuesto se decide sobre la base de la profundidad de la región del cerebro que se específica (es decir, 5 mm) y teniendo en cuenta el grosor del cráneo (~ 1 mm) y distancia de trabajo por encima de la cabeza ( por ejemplo, de 1-2 mm). Así, la distancia predeterminada de la punta de la micro cánula al ángulo derecho de imponer a las manifestaciones actuales fue de 7-8 mm. Un lápiz de diamante se utiliza para cortar el tubo de borosilicato de aproximadamente 8 mm proximal al ángulo derecho.

Figura 2: Preparación de la micro cánula. (A) Un extractor de electrodos (Stoelting Co. Wood Dale, IL) se utiliza para producir una micro cánula con un mango largo, que adelgaza. (B) La bobina de calentamiento pueden ser reorientados para facilitar su uso, y la micro cánula se coloca dentro de la bobina, lo que permite una curva en ángulo recto para formar el uso de fórceps en el tubo de vidrio se calienta.

Después de que el número deseado de microcánulas se ha hecho, se recomienda la esterilización con óxido de etileno o el uso de un autoclave. El mm más distal 1-2 de la micro cánula puede ser coloreado con un marcador quirúrgico estéril (o tinta indeleble antes de la esterilización) para permitir que la punta de la micro cánula que se visualiza fácilmente durante el procedimiento quirúrgico.

MOP preparación

MOP se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, la brida de plástico de la tubería de acero inoxidable RP ("flujo modulador") se elimina primero con unas tijeras o pinzas para. Un trozo de tubo de polietileno (plástico One, Roanoke, VA, # C312 TV, OD, 1,22 mm; ID: 0,72 mm) se une a la superficie de tubos de acero inoxidable antes ocupado por la brida (~ 4 mm) mediante la inserción del acero inoxidable tubos de acero en el lumen del tubo de polietileno y asegurar con un adhesivo adecuado alrededor de la circunferencia exterior de la conexión. LumaBond (myNeuroLab, Inc., St. Louis, MO) es particularmente útil como cura en cuestión de segundos con la exposición a la luz enfocada (por ejemplo, de una lámpara de fibra óptica). La longitud de la tubería debe ser aproximadamente la distancia entre la base del cráneo del animal y el aspecto más rostral de la escápula (por ejemplo, aproximadamente 1,5 a 3,0 cm para las ratas de laboratorio). La bomba se llena con las instrucciones, y el tubo de acero inoxidable Alzet, con la longitud de tubo de polietileno conectado a su parte, se introduce en la bomba de llenado. Un pequeño volumen de la solución de la bomba se verá obligado por el exterior de la interfaz de la bomba-tubería (y debe ser secó de distancia) y también en la región proximal de la tubería de polietileno. La bomba llena de tubos conectados se incuba en una solución salina estéril durante 12 horas a 37 º C. Si la bomba está funcionando correctamente, después de este período de incubación, el líquido se verá que han viajado unos pocos milímetros en el tubo de polietileno.

Construir ión del sistema microinfusión

La bomba con su tubo conectado se encuentra inmersa en una placa de Petri de 10 cm que contienen una solución salina estéril, y el aire que queda dentro de la tubería de polietileno se elimina con una jeringa llena con la misma solución contenido en la bomba y que ha sido equipado con tubos de pequeño diámetro que se pueden insertar dentro de la tubería de polietileno. Solución así puede ser inyectado en el tubo de polietileno para reemplazar el aire. Del mismo modo, la micro cánula se sumerge en el baño de solución salina y se remueve el aire mediante la inyección con la solución. Esto se logra fácilmente con una solución llena de segunda jeringa con flexibles (por ejemplo, silicona) tubo que se coloca sobre los grandes (proximal) de la micro cánula.

El extremo proximal del tubo de borosilicato se inserta en el tubo de polietileno. Tenga en cuenta que esto puede requerir la dilatación de la tubería de polietileno, presionando firmemente con las puntas cerradas de microforceps en la luz lo que quema la apertura para facilitar la inserción de los tubos de borosilicato. El sistema de infusión de aire libre se retira del baño de solución salina y se coloca sobre una superficie estéril y seca suavemente con una gasa o un hisopo de algodón. La conexión del tubo de polietileno micro cánula se asegura con una capa circunferencial de adhesivo (por ejemplo, LumaBond).

Si el sistema está bien montado, y si el MOP continúa funcionando como debería, durante la etapa final de este procedimiento una gota de solución suele aparecer en la punta de la micro cánula como el mecanismo osmótico dentro de la bomba continúa durante la preparación. MOP tasa de flujo puede ser reducido proporcionalmente al cubrir la superficie con parafina adecuada según las instrucciones del fabricante. De las manifestaciones actuales, el 50% de cada MOP se recubrió con un breve chapuzón en la parafina derretida y dejarla enfriar, reduciendo así la velocidad de flujo por medio de 0.125 l / hr. El sistema microinfusión terminado se sumerge en solución salina estéril y se almacena a 37 ° C hasta la implantación.

La implantación del sistema microinfusión

El sistema microinfusión se implanta usando métodos estándar estereotáxica como se describió previamente (Cooley, 1990). Después de la preparación del campo quirúrgico, un agujero de trépano se perfora para la entrada de la micro cánula. Si lo desea, los tornillos de cabeza también se puede colocar para estabilizar el compuesto adhesivo utilizado para fijar el micro cánula. El compuesto utilizado en este laboratorio (Geribond, Den-Mat Inc., Santa Maria, CA) no requiere de anclaje adicionales, sin embargo, la superficie del cráneo debe ser preparado por la limpieza con un bastoncillo de algodón acetonedampened. Un diámetro de 1-2 mm "gancho" se hace en el extremo distal del alambre de la alineación (ver fig. 1), lo que le permite rodear la curva del tubo de borosilicato. Es entonces seguro (utilizando LumaBond), en una orientación a lo largo del mismo eje de la porción distal de la micro cánula (que ha de adelantarse en el cerebro, ver fig. 3B). El sistema de infusión, se monta en el soporte estereotáxica (Fig. 3), el cable de sujeción a la alineación titular. Suturas quirúrgicas se utiliza para atar la bomba de infusión a la parte superior del manipulador estereotáxica, por lo tanto, la suspensión y evitar la pérdida de la orientación durante el procedimiento por el peso (y el par) de la bomba (Fig. 3B). El microcánula entonces se puede colocar en la orientación deseada (por ejemplo, precisamente vertical) mediante el uso de unas pinzas para doblar con cuidado el cable de la alineación distal a la abrazadera de soporte. La punta de la micro cánula se coloca sobre un punto de referencia (por ejemplo, o bregma lambda) y luego maniobró hasta el punto de entrada en el cerebro. Las coordenadas utilizadas para los animales en estos experimentos fueron: Bregma 0,2 mm, 3,2 mm lateral y ventral 5,0 mm por debajo de la duramadre con la cabeza del animal en una posición de cabeza plana.

Después de la micro cánula se avanza hasta la profundidad adecuada en el cerebro, el sistema se fija en su posición con un compuesto de pedestal (por ejemplo, Geribond). El pedestal se puede esculpir cerca de la superficie del cráneo para facilitar el cierre de la herida. Después de que el compuesto pedestal ha curado (~ 2 min), el cable de la alineación se corta a ras del pedestal con rueda de corte de la broca. Una pequeña cantidad de compuesto puede ser utilizado para cubrir y alisar la púa restantes del cable cortado. El MOP se inserta por vía subcutánea, situada entre la escápula del animal. Finalmente, la herida es lavado con solución salina estéril, y se cierra la incisión con suturas o clips de la herida (Fig. 3, panel D).

sistema croinfusion se coloca para la colocación y fijación dentro de un animal. (D) El diseño del sistema de microinfusión permite el cierre fácil de la incisión sobre un pedestal de perfil bajo, reduciendo el riesgo de infección y reducir al mínimo las molestias para el animal. "Width =" 511 "height =" 381 "/>
Figura 3: Implantación de sistema de microinfusión. (A) Colocación del sistema microinfusión en el instrumento estereotáxico. (B) El MOP está atado con suturas quirúrgicas para evitar que el peso de alterar la orientación de la micro cánula. El microcánula se coloca para la entrada de precisión vertical en el cerebro utilizando el cable de la alineación. (C) Un sistema de microinfusión se coloca para la colocación y fijación dentro de un animal. (D) El diseño del sistema de microinfusión permite el cierre fácil de la incisión sobre un pedestal de perfil bajo, reduciendo el riesgo de infección y reducir al mínimo las molestias para el animal.

Preparación e implantación de sistema de infusión estándar

El procedimiento para la preparación del sistema de infusión estándar es idéntica a la del sistema de microinfusión excepto el microcánula se sustituye por una "bomba osmótica conector de la cánula" con un diámetro de 300 micras (28 ga, plásticos One, Roanoke, VA, # 3300PM / SPC, ver Fig. 5a). La implantación del sistema estándar es también idéntica a la del sistema de microinfusión, incluyendo la fijación de un cable de la alineación para permitir un posicionamiento preciso vertical de la cánula de entrada en el cerebro.

Histología y Análisis

Para examinar la capacidad del sistema para proporcionar microinfusión prestación sostenida de Fast Green, grupos de tres animales fueron sacrificados a las 12 horas, día 1, día 2, y 4 días después de la cirugía. Los sujetos fueron profundamente anestesiados con pentobarbital sódico (120 mg / kg, ip) y transcardially perfundidos con 200 ml de 0,1 M tampón fosfato salino (PBS), seguido por 400 ml de paraformaldehído al 4% en 0,1 M tampón fosfato. Soluciones para infusión se mantuvieron a 4 ° C, con un pH de 7,4 y perfundido a una velocidad de 50 ml por minuto, utilizando una bomba peristáltica. Con el fin de eliminar las cánulas sin dañar los tejidos post-mortem, los animales perfundidos se fijó en un marco estereotáxico, el pedestal se fija con pegamento a un cable rígido unido a la abrazadera del brazo manipulador, y el cráneo se retiró cuidadosamente de todo el pedestal con una fresa dental. El pedestal y la cánula subyacentes fueron retirados por lo tanto a lo largo de la trayectoria del mismo en el que se adelantó la cánula para su colocación. Los cerebros fueron removidos de la bóveda craneal y se sumergen durante 12 horas en el mismo fijador.

Para la evaluación de la infusión constante de Fast Green, las secciones con un espesor de 200 micras fueron cortadas con un Vibratome (myNeuroLab, St. Louis, MO) y se montaron en portaobjetos de vidrio mojado. Secciones representativas fueron fotografiadas con una cámara Canon CanoScan LiDE 600F escáner. Para la evaluación de trauma local y gliosis reactiva, 70μm secciones Vibratome fueron los primeros en mojado montado y fotografiado sin mancha para evitar la distorsión del tejido que puede ocurrir con los procesos histológicos, como el secado, coloración, y la deshidratación. Estas mismas secciones se dejó secar en sus placas de vidrio recubiertos de gelatina, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E), se deshidrataron con alcoholes clasificado, y la cubierta-se deslizó con Permount.

Adyacente 70 micras secciones se sometieron a un procedimiento estándar de inmunofluorescencia para detectar proteína ácida glial fibrilar (GFAP), que se expresa por los astrocitos en el proceso de gliosis reactiva en respuesta a un trauma (Ding et al, 2000;.. Ma et al, 1991). En pocas palabras, de libre flotación secciones fueron lavadas con PBS y se bloquearon con 10% de suero normal de burro (NDS) y el 3% de albúmina sérica bovina en PBS 0,1 M con 0,3% Triton X-100 (PBS / Triton) durante una hora y luego se incubaron en conejo anti-GFAP anticuerpos (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en PBS / Triton con un 1% NDS durante 12 horas a 4 ° C. Secciones fueron lavadas con PBS y se incubaron con Alexa Fluor ® 594 burros antirabbit secundaria de anticuerpos (1:500; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) en PBS con 5% de NDS durante una hora a temperatura ambiente. Las secciones fueron lavadas a fondo de nuevo con PBS y contrastados con NeuroTrace ® verde fluorescente Nissl mancha (1:500 en PBS durante 5 minutos; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Después de un enjuague final con PBS, las secciones fueron montadas en gelatina revestida de diapositivas y cubreobjetos con Slow-Fade (Molecular Sondas). Todas las fotomicrografías fueron adquiridas mediante un microscopio Axioskop Zeiss con software AxioVision (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

Resultados

En pruebas in vitro

Antes de la evaluación de los animales, tres sistemas de microinfusión se prepararon mediante la colocación de sus Fast Green llena de reuniones de las Partes en en un compartimiento (15 ml tubo cónico) y poner su microcánulas en un segundo compartimiento (1 ml Epp Endorf tubo), solución salina estéril que contiene a 37 ° C. Cada sistema ha demostrado un flujo continuo de tinte más de 12 horas de observación. La Figura 4 muestra la función de un sistema típico de más de 3 horas.

Figura 4: En la demostración in vitro de la función microinfusión sistema. (A) Flujo de colorante Fast Green es fácil de ver sin obstáculos de la micro cánula en el comienzo de un período de prueba in vitro. (B) Como el flujo continúa, la solución de reserva se satura (B) y, finalmente, opaca, con color (C).

Evaluación en el sistema de microinfusión vivo

Después de la perfusión, las microcánulas eliminado y sus conexiones fueron inspeccionados cuidadosamente, y todos resultaron ser completamente intacta. Por lo tanto, no se produjo la rotura del vidrio de borosilicato en el tejido, ni hubo defectos en las conexiones de los componentes del sistema. A 10. L de solución salina jeringa Hamilton, con una longitud de tubo de silicona conectado a su aguja se utiliza para aplicar el flujo suave para el extremo del corte de la tubería de polietileno conectado a la micro cánula. Las doce de la microcánulas permite el flujo continuo y no parecen estar obstruidos. Además, después de la eliminación de cada uno de RP de los animales, el volumen de la solución restante fue medido y apropiado para el caudal del MOP (0.125 l / h) y la cantidad de tiempo que se le permitiera funcionar.

Administración in vivo

Evaluación de las secciones coronal del tejido infundido con Fast Green demostró poca variabilidad en la distribución entre los animales dentro de los grupos en cualquier punto de tiempo dado (12 horas, 1 día, 2 días y 4 días). La Figura 5 ilustra las áreas representativas de la difusión de Fast Green en estos dos momentos que muestran un aumento progresivo de la infiltración de tinte más de cuatro días. Tenga en cuenta que los experimentos anteriores con una mayor concentración de Fast Green (por ejemplo, 5 - 15%) resultaron en una rápida opacificación del parénquima, por lo que oculta la evaluación precisa de la función del sistema microinfusión lo largo del tiempo. Mientras que el alcance de la difusión del colorante al 1% puede ser difícil determinar con precisión en la inspección macroscópica, las áreas de infiltración eran fácilmente discernibles con un aumento de 2,5 veces, y se indican con líneas discontinuas en la Figura 5.

Figura 5: En vivo demonstation de microinfusión sostenido de Fast Green. (A) Doce horas después de la colocación de un sistema de intraestriatal microinfusión Fast Green-cargado, el tinte se ve la difusión en el parénquima que rodea el sitio microcánula. Observaciones en un día (B), 2 días (C), y 4 días (D) indican una provisión continua de una solución rápida verdes con áreas de aumento de la infiltración de colorante. El límite exterior de la difusión se observó bajo microscopio de baja potencia y se indica aquí con líneas discontinuas. Barra de escala, de 2 mm.

Evaluación del traumatismo y gliosis reactiva

Observación bruto de recién cortada, las secciones de tejido teñidas mostró que el sistema microinfusión resultó en una reducción de un traumatismo localizado en el lugar de entrega. La cánula estándar fue visto siempre para desestabilizar y desplazar a un área mayor de tejido (Fig. 6B y C), que se aprecia mejor a una potencia mayor con H & E (Fig. 6D & E). Por otra parte, la sangre se ve con frecuencia acumulada en el sitio de infusión estándar (Fig. 6D), lo que sugiere un mayor grado de compromiso de la vasculatura y lo que implica disminución de la integridad de la barrera hematoencefálica.

El sistema microinfusión también dio lugar a gliosis reactiva reducido en gran medida como lo demuestra la disminución de la inmunorreactividad para GFAP en los alrededores de la infusión a través de una micro cánula (Fig. 6G) en comparación con una cánula estándar (Fig. 6F). Mientras microcánula inducida por tinción GFAP fue elevado por encima de los niveles normales (Fig. 6H), la escalada sorprendente en gliosis reactiva con el estándar de la colocación de la cánula de infusión y (6F) no se observó cuando el sistema fue empleado microinfusión.

Ivery cánula después de 5 días de la infusión de solución salina. (A) A microcánula sacado de tubos de borosilicato con un diámetro de la punta de los 50. M permite el flujo libre y sin restricciones de la mayoría de los agentes neuroactivos, sin embargo, es 6 veces más pequeño que un parto normal cánula (28 ga, 0,30 mm). (B, C) se monta sin teñir, húmedo de las secciones coronal (grosor, 70. M) que ilustra un mayor daño tisular local (flechas) causada por una norma de la cánula (B) en comparación con un micro cánula (C). (D, E) Mayor poder de microfotografías de las secciones de H & E manchadas se muestra en B y C, respectivamente. La norma cánula causado lesiones traumáticas más amplio, como se ilustra en la D, después de haber desplazado a un área de tejido y causando mayor insulto a la vasculatura, como lo demuestra la colección de sangre dentro de la cavidad de la lesión (flecha). La lesión causada por el micro cánula, sin embargo, es considerablemente más pequeño y menos perjudicial para el tejido en el lugar de la infusión. (F, G, H) Inmunofluorescencia contra GFAP demuestra aumentado dramáticamente el número de astrocitos GFAP + alrededor de la lesión de la cánula estándar (F) en comparación con el de la micro cánula (G) y el cuerpo estriado normal, unlesioned (H). Las barras de escala: A & B, 1 mm; D - H, 250 m. "/>.
Figura 6: trauma localizada causada por un micro cánula en comparación con una cánula de entrega estándar después de 5 días de la infusión de solución salina. (A) A microcánula sacado de tubos de borosilicato con un diámetro de la punta de 50 micras, permite el flujo libre y sin restricciones de la mayoría de los agentes neuroactivos, sin embargo, es 6 veces más pequeño que un parto normal cánula (28 ga, 0,30 mm). (B, C) se monta sin teñir, húmedo de las secciones coronal (grosor, 70 m) que ilustra un mayor daño tisular local (flechas) causada por una cánula estándar (B) en comparación con un micro cánula (C). (D, E) Mayor poder de microfotografías de las secciones de H & E manchadas se muestra en B y C, respectivamente. La norma cánula causado lesiones traumáticas más amplio, como se ilustra en la D, después de haber desplazado a un área de tejido y causando mayor insulto a la vasculatura, como lo demuestra la colección de sangre dentro de la cavidad de la lesión (flecha). La lesión causada por el micro cánula, sin embargo, es considerablemente más pequeño y menos perjudicial para el tejido en el lugar de la infusión. (F, G, H) Inmunofluorescencia contra GFAP demuestra aumentado dramáticamente el número de astrocitos GFAP + alrededor de la lesión de la cánula estándar (F) en comparación con el de la micro cánula (G) y el cuerpo estriado normal, unlesioned (H). Las barras de escala: A & B, 1 mm; D - H, 250 micras.

Discusión

Diversos estudios han demostrado que al disminuir el tamaño de la cánula de entrega de las infusiones intracerebral, el trauma tisular y un insulto a la barrera sanguínea del cerebro se reduce (Perry et al., 1993), la inflamación se reduce y atenúa la respuesta inmune (Finsen et al gliosis., 1991), y reactiva se ve disminuida (Nikkhah et al., 1994). En este trabajo presentamos un método para la entrega de los agentes neuroactivos crónica en el cerebro a través de una micro cánula con un diámetro que se reduce de 6 veces en compara...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mini-osmotic pumps (MOPs)	Tool	ALZET	model #1002
Electrode puller	Tool	Stoelting Co.
Borosilicate tubing	Surgery	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-6
Microforceps	Surgery	World Precision Instruments, Inc.
Polyethylene tubing	Surgery	Plastics One	#C312 VT
LumaBond	Reagent	myNeuroLab, Inc