Hacer patch pipetas y electrodos de Sharp con un extractor programable

Resumen

Este vídeo muestra cómo usar un extractor de programación para pipetas de parches y electrodos para electrofisiología fuerte. El mismo procedimiento puede ser utilizado para hacer una variedad de herramientas de vidrio, incluyendo agujas de inyección.

Resumen

Microelectrodos de vidrio (también llamado pipetas) han sido un caballo de batalla de la electrofisiología durante décadas. Hoy en día, las pipetas son hechas de capilares de vidrio con un extractor programables. El calor de esos instrumentos el capilar utilizando un filamento de metal o un láser y sacar el cristal con la gravedad, un motor o ambos. Pipetas para la grabación de patch-clamp se forman con el calor y sólo la gravedad, mientras que los electrodos de registro intracelular fuerte uso de una combinación de calor, la gravedad, y un motor. El procedimiento utilizado para pipetas intracelular de grabación es similar a la utilizada para fabricar agujas de inyección para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inyección de cRNA en ovocitos de Xenopus. En vidrio en general, capilar <1,2 mm de diámetro se utiliza para hacer las pipetas para la grabación de patch clamp, mientras más estrecho de vidrio se utiliza para el registro intracelular (diámetro externo = 1,0 mm). Para cada herramienta, el tirador está programado de forma ligeramente diferente. Este video muestra cómo hacer que los dos tipos de pipetas de grabación mediante programas preestablecidos extractor.

Protocolo

Pipetas tirando

El uso de un extractor de microelectrodos como el Sutter P-97 Flaming / Brown, tirar de un conjunto de aproximadamente 10 a 20 pipetas.

1. Seleccione su vaso capilar. Usamos borosilicato capilares (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm de diámetro exterior, diámetro interior 1,1 mm, 10 cm de largo). Almacenar el vidrio con cuidado para que permanezca limpia y libre de polvo.
2. Diseñar un programa de extracción. Nosotros usamos un programa de cinco pasos, con el calor y la velocidad desciende a cada paso, y un sofá pequeño en el paso final. Libro de cocina de Sutter pipeta es una excelente referencia para el desarrollo de programas adecuados.
3. Examine la punta de la pipeta con un microscopio para determinar el diámetro de apertura y suavidad. Deseche las puntas ásperas, desiguales o irregulares. Un buen protocolo tirando debe garantizar que estos son poco frecuentes. Para el estándar de grabación de patch-clamp, las aberturas de punta debe ser 1.3 micrones de diámetro. Un cono empinado (punta roma) conduce a una menor resistencia para el diámetro de apertura. Forma y tamaño pueden ser modificados por la presión de pulido.

Pipetas de fuego pulido

1. Establecer una plataforma de pulir (microforge) con un filamento de platino de calefacción controlado por un pedal. Un kit de útiles está disponible a partir de ALA Científicas (CPM-2) o un aparato similar se puede montar poco a poco.
2. Opcional: Escudo de la pipeta con un aislante para reducir la capacidad y mejorar las características de ruido. Nosotros usamos la cera dental. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil elastómero de siloxano también conocido como PDMS) es también una opción.
3. Si se utiliza la cera, mantener un suministro de líquido pequeños cerca. Con la presión del aire en la parte posterior de la pipeta para mantener la cera de entrar en la pipeta, moje la punta brevemente en la cera líquida y remover. Con Sylgard, elastómero tienda preparado en alícuotas congeladas y pintar la punta de la pipeta con un microscopio. Calor para curar el elastómero.
4. Coloque la pipeta (recubiertos o no) en el aparato de pulir y llevar la punta ~ 50 micrones del filamento. Tenga en cuenta que el filamento se expande cuando se calienta.
5. Recomendado: Siga el protocolo para "pulir la presión" para cambiar la forma de la pipeta para una óptima resistencia y diámetro de la punta.
6. Un pulso de calor breve (1-2 segundos) es suficiente para quitar la cera de la punta de la pipeta y el vidrio suave.
7. Coloque la pipeta terminó en una caja cerrada para proteger del polvo, de repetición para 10 pipetas de éxito.

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Discusión

El protocolo se ilustra aquí es de uso diario en los laboratorios de electrofisiología, y también se utiliza para fabricar agujas de inyección de células y animales. Con un extractor de programación, es fácil de hacer pipetas para una variedad de usos. Con atención y cuidado, el filamento en su extractor tendrá una duración de un año o más. Buena suerte con sus experimentos.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.