1. Preparación

1. Antes de comenzar, ponte guantes de laboratorio y ropa protectora adecuada.
2. Lave todas las herramientas de disección, primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego séquelas con una toalla de papel limpia.
3. Preparar 200 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene un 2% de suero de becerro fetal (FCS).

2. Disección

1. Ancle un ratón eutanasiado en una placa de disección en la posición supina.
2. Usando tijeras y fórceps realizar una laparotomía longitudinal para acceder a la cavidad torácica.
3. Retire el corazón para acceder al timo, que se encuentra por encima del corazón. Luego, identifica el timo, que se compone de dos lóbulos blancos y se encuentra en la cavidad torácica por encima del corazón.
4. Usando fórceps separa cuidadosamente el timo y colócalo en el plato Petri con 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Aislamiento de células inmunes

1. Coloque el timo en un colador de células de 40 m sobre el mismo plato de Petri. Aplastar el timo con un émbolo para disociarlo en el mismo plato.
2. Transfiera el timo disociado y el líquido a un tubo centrífugo de 15 ml.
3. Lavar el plato Petri con 5 ml de HBSS 2% FCS y transferir el medio lavado también en el mismo tubo centrífugo.
4. Centrifugar el tubo a 370 x g durante 7 min a 20oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
5. Resuspenda el pellet en 2 ml de acetato de potasio para lisar los eritrocitos. Espere 2 minutos y luego suba el volumen hasta 14 ml usando HBSS 2% FCS.
6. Centrifugar el tubo de nuevo a 370 x g durante 7 min a 20oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de HBSS 2% FCS.
7. Calcule la concentración celular utilizando el ensayo de tinción azul trypan y ajuste la concentración celular final a 10⁷ células/ml utilizando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

4. Etiquetado magnético de las células inmunitarias

1. Tome dos tubos FACS. Etiquetar un tubo, "células T no enriquecidas", y el otro tubo, "células T enriquecidas", que se separarán mediante etiquetado magnético.
2. Distribuir la solución celular en cada uno de los dos tubos FACS.
3. Centrifugar el tubo de "células T enriquecidas" a 370 x g durante 3 min a 20oC y desechar el sobrenadante evitando el pellet.
4. Resuspenda el pellet en 250 ml de mezcla de anticuerpos biotinilados anti-CD3 (Tabla 1, Mezcla 1).

Tabla 1: Los anticuerpos mezclan composición. Las mezclas 1 y 2 se utilizan para la separación magnética. Mix 3 se utiliza para evaluar el enriquecimiento celular después de la separación magnética.

5. Incubar la mezcla de anticuerpos de suspensión celular durante 15 minutos a 4oC en la oscuridad.
6. Añadir 3 ml de HBSS 2% FCS a ambos tubos y centrifugarlos de nuevo a 370 x g durante 3 min a 20oC.
7. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en perlas acopladas con estreptavidina de 250 ol (Tabla 1, Mezcla 2).
8. Incubar la mezcla celular y las cuentas durante 20 minutos sobre hielo.
9. A continuación, añadir 3 ml de HBSS 2% FCS y mezclar bien y centrifugar de nuevo a 370 x g durante 3 min a 20 oC.
10. Resuspenda el pellet en 2 ml de HBSS 2% FCS.

5. Separación magnética de células CD3-positivas

1. Coloque la columna en el imán y agregue 3 ml de HBSS 2% FCS para humidificar el sistema. Espera 5 minutos.
2. A continuación, clasifique las celdas etiquetadas en la columna.
3. Después de que la suspensión celular pase a través de la columna, lave la columna X3 veces con 3 ml de HBSS 2% FCS.
4. A continuación, retire la columna del imán y colóquela en un tubo de recogida de 15 ml.
5. Para eluir las celdas de destino, agregue 5 ml de HBSS 2% FCS a la columna y enjuague la columna con el émbolo.
6. Repita el paso de elución con otros 5 ml de HBSS 2% FCS.

6. Evaluación del enriquecimiento de células objetivo por citometría de flujo

1. Transfiera 500 l de suspensión celular eluida a un tubo FACS etiquetado como "células T enriquecidas". Transfiera 200 l de suspensión de "células T no enriquecidas" a un segundo FACS.
2. A continuación, centrifugar ambos tubos a 370 x g durante 7 min a 20oC.
3. Deseche el sobrenadante y, a continuación, añada 100 ml de anticuerpo fluorescente Mix 3 (ver Tabla 1) a ambos tubos.
4. Incubar ambos tubos durante 20 min a 4oC en la oscuridad.
5. A continuación, añadir 3 ml de HBSS 2% FCS a los tubos y centrifugarlos a 370 x g durante 3 min a 20oC.
6. Deseche el sobrenadante y, a continuación, vuelva a suspender cada tubo en 250 ml de HBSS 2% FCS.
7. Ahora, evalúe la tasa de enriquecimiento celular CD3-positiva por citometría de flujo.

7. Análisis de datos

1. Abra el icono 'FlowJo' y arrastre los archivos para cada tubo en la ventana"Toda la muestra".
2. Haga doble clic en el archivo "células T enriquecidas" para mostrar la gráfica de puntos que muestra la dispersión hacia delante (FSC-A) en el eje X y la dispersión lateral (SSC-A) en el eje Y.
3. Haga clic en"Polígono"para rodear las poblaciones de linfocitos.
4. A continuación, haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana.
5. Seleccione "FSC-W" en el eje Y y "FSC-A" en el eje X, y circule las celdas negativas FSA-W. En la ventana"Identificación de subpoblación",asigne a la población de células el nombre "células únicas".
6. Haga doble clic en la población en círculos para crear una nueva ventana. Seleccione "CD3"en el eje Y y circule las celdas con título CD3. En la ventana"Identificación de subpoblación"nombre su población celular "células T".
7. Repita con las "células T no enriquecidas".
8. Para visualizar la población de celdas, haga clic en " Editor dediseño" y arrastre la población"Células T"de "células T enriquecidas" y "células T no enriquecidas" a la pestaña.
9. Aparecerán gráficas de puntos que representan linfocitos CD3+. Las células CD3+ solo deben aparecer en la población de interés en el tubo enriquecido CD3+.
10. Para evaluar el enriquecimiento de linfocitos CD3+ en las células ordenadas, haga clic en"Editorde tablas", y luego arrastre la población de "células T" de "células T enriquecidas" y "células T no enriquecidas" a la tabla.
11. En el menú"Estadística",seleccione"Frecuencia de linfocitos" célulaspara comprobar el porcentaje de células CD3+ en todos los linfocitos, luego haga clic en"Crear tabla".
12. Los valores de parámetro aparecerán en una nueva tabla. Para las "células T enriquecidas", la frecuencia de las células CD3+ debe ser de alrededor del 80%.