1. Configuración

Búferes y reactivos

1. Salina estéril con fosfato (PBS) sin calcio o magnesio
2. Tampón de recubrimiento: PBS estéril o tampón de carbonato
3. Ensayo diluyente- 10% suero bovino fetal (FBS) en PBS
4. Cultivo celular medio- RPMI 1640 con 10% FBS, penicilina/estreptomicina, y L-glutamina
5. Tampón de lavado- PBS que contiene 0.05% Tween20
6. Agua destilada doble (ddH₂O)
7. Sustrato de detección- 100 mg AEC (3-amino-9-etil-carbazol) en 10 mL DMF (N,N, Dimetilformamida).

Equipo

8. Capucha de flujo laminar
9. Incubadora humedecida (establecida a 37oC, 5% CO₂)
10. Lector ELISPOT automatizado o microscopio de disección

Materiales

11. Placas ELISPOT
12. Reservorios estériles y no estériles
13. Pipettors y puntas
14. Pipetas serológicas estériles
15. Tubos de polipropileno cónicos estériles
16. Dos botellas de compresión para el lavado de placas

Reactivos específicos de ensayo

17. Células- células primarias o líneas celulares (aquí, se utilizaron esplenocitos de ratones C57BL/6)
18. Estimulantes- mitógeno o antígeno (aquí, se utilizaron phorbol 12-miristate 13-acetate (PMA, 50 ng/mL) e ionomicina (1 m))
19. Anticuerpo primario- anticuerpo anticitoquina biotinilado (diluido a 2 g/ml en el diluyente del ensayo)
20. Anticuerpo secundario- estreptavidina-caballo de peroxidasa (SAv-HRP)

2. Procedimiento

Capa

1. Manteniendo las condiciones estériles y dentro de una campana de flujo laminar, diluya el anticuerpo purificado de captura anticitoquina a una concentración final de 0,5-4,0 g/ml en tampón de recubrimiento estéril. (Nota: para IFN- e IL-6 utilizan 5 g/ml).
2. Transfiera la solución de anticuerpos de captura, de 100 ml/bien, a la placa ELISPOT.
3. Cubra la placa con una cubierta de placa y séllela para evitar la evaporación.
4. Incubar la placa durante la noche a 4oC.

Bloqueo

5. Al día siguiente, descubra la placa ELISPOT en la campana de flujo laminar. Invierta rápidamente la placa en toallitas estériles para eliminar la solución de anticuerpos de captura de cada pocal.
6. A continuación, agregue 200 s de medio de cultivo celular a cada poca. Este paso bloqueará el enlace no específico durante el ensayo.
7. Sustituya la cubierta de la placa e incubar la placa durante 2 horas a 37oC.

Placado y Activación de Células

8. Mientras la placa se está incubando, prepare una solución de 2x mitogenos que contenga 50 ng/ml de PMA y 1 m de ionomicina en el medio de cultivo celular.
9. Luego, prepare suspensiones celulares objetivo a una concentración de stock de 2 x 10⁶ células/ml.
10. Una vez completada la incubación, retire el medio de cultivo celular de cada pocal invirtiendo rápidamente la placa en toallitas estériles dentro de la campana de flujo laminar.
11. A continuación, genere una dilución en serie 2X de la solución de suspensión de celda sin material. Para ello, primero agregue 200 l de la solución de material de suspensión celular preparada en los pozos de la fila superior de la placa ELISPOT.
12. A continuación, agregue 100 l de medio de cultivo de celda sin formato a las siguientes cinco filas de la placa debajo de las filas que contienen la solución de culata.
13. Después de eso, realice una dilución en serie 2X pipeteando 100 l de la suspensión celular desde la fila superior en la fila directamente debajo. Asegurar una mezcla adecuada pipeteando suavemente esta solución hacia arriba y hacia abajo para asegurar una distribución uniforme de las células.
14. Repita este proceso para las cuatro filas restantes.
15. Deje la sexta fila con el medio de cultivo solamente. Servirá como control experimental.
16. A continuación, añadir 100 l de la solución de mitogeno preparada a los pozos experimentales de las primeras cinco filas de la placa. En los pozos de control y la sexta fila, agregue 100 l de los medios de cultivo celular sin mitón.
17. Sustituya la cubierta de la placa y la placa de incubación a 37oC, 5% CO₂ en una incubadora durante 20-48 horas. (Nota: 20-24 horas es típicamente suficiente para detectar IL-2 y TNF- , mientras que 48 horas es óptima para IL-4 e IFN-).

Detección

Anticuerpo primario

18. Preparar el anticuerpo anticitoquina biotinilado a una concentración de 2 g/ml en el diluyente del ensayo.
19. Prepare 20-25 ml de tampón de lavado en este momento mezclando 0.05% Tween-20 en PBS.
20. Una vez completada la incubación, destapa ralentí la placa y invirte rápidamente sobre un fregadero para eliminar todo el líquido de los pozos. (Nota: Después de este punto, la placa ya no tiene que mantenerse estéril).
21. A continuación, lave la placa añadiendo un tampón de lavado de 200 l a cada poca. Expulse este líquido invirtiendo y deslizando rápidamente la placa sobre un fregadero. Repita este proceso para un total de cinco lavados.
22. A continuación, añadir 100 l de la solución de anticuerpos de detección de anticitoquinas biotiladas diluidas a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.

Anticuerpo secundario

23. Una vez completada la incubación, expulse el anticuerpo de detección invirtiendo y deslizando la placa sobre el fregadero.
24. Como antes, lave la placa 5 veces con tampón de lavado de 200 l, expulsando el líquido entre cada lavado.
25. A continuación, añadir 100 l de solución diluida de estreptavidina-caballo de peroxidasa a cada pocal (diluido a su concentración óptima predeterminada en diluyente de ensayo).
26. Sustituya la cubierta de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 1,5-2 horas a 37oC.

Sustrato

27. Después de la incubación, no más de 15 minutos antes de su uso, primero active la solución de sustrato AEC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
28. A continuación, deseche el contenido de los pozos y lave el plato cinco veces con tampón de lavado, como antes.
29. A continuación, agregue inmediatamente 100 ml de solución de sustrato AEC preparada en cada poca.
30. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10-20 minutos mientras supervisa el desarrollo del punto.
31. Detenga la reacción encerrando la placa con agua y moviendo la placa sobre el fregadero.
32. Borre la placa sobre toallas de papel y deje que la placa se seque al aire durante la noche o hasta que esté completamente seca. Extracción de la bandeja de plástico debajo de la placa facilitará el secado.

3. Adquisición y Análisis de Datos

1. Después del secado, las manchas están listas para ser contadas con un lector de placas automatizado. Aquí, se utiliza el lector de inmunopuntoctl, pero este protocolo se puede adaptar para cualquier lector.
2. Primero encienda el instrumento, luego el ordenador. A continuación, abra el programa CTL y haga clic en "scan count."
3. Presione "expulsar" para que la bandeja se extienda desde la máquina. A continuación, retire el adaptador de plástico y alinee la fila "A" en la placa Y el adaptador ELISPOT.
4. Elija un nombre de archivo y una ubicación para el archivo que desea guardar y cargue la placa en la bandeja.
5. A continuación, haga clic en "cargar" en el software y cierre la puerta en el lado de la máquina.
6. Pulse "start- after counting." Asegúrese de que el archivo está guardado y, a continuación, abra el software de control de calidad "QC" para analizar los datos y contar el número de puntos.

Notas:

1. El número mínimo de celdas debe determinarse en experimentos preliminares. El número óptimo de puntos es de 50 euros/bueno. Si se cargan demasiadas celdas, será difícil detectar puntos distintos. Además, las células se superponen y no pueden formar una monocapa en la membrana, por lo que el nivel de detección puede reducirse.
2. Al optimizar el experimento, tenga en cuenta el nivel de expresión esperado de la proteína objetivo. Cuanto menor sea la expresión, mayor será el número de celdas requeridas por pozo.
3. A diferencia de ELISA, es mejor lavar a mano la placa en lugar de usar una lavadora de placas. Las placas ELISPOT son más delicadas y se debe evitar punción de la membrana PVDF.
4. Uno debe limitar el movimiento de la placa durante el período de incubación, ya que puede hacer que las manchas se difuminen.
5. Las placas deben almacenarse en la oscuridad, ya que la exposición a la luz directa hace que las manchas se desvanezcan.