Este trabajo fue apoyado por la National Science Fundación de Becas de Postgrado de Investigación de SK y los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01EB008722.

A. Preparación de Material y Esterilización <ol><li> Antes de la preparación de materiales de encapsulación, preparar una solución de 0,5% en peso del fotoiniciador Irgacure 2959 (I2959) en tampón fosfato salino (PBS), mezclando e incubando durante varios días a 37 ° C. La solución puede ser filtrada para la esterilización de la jeringa y se almacena a temperatura ambiente durante el uso prolongado. </li><li> Sobre la base de la composición deseada de los geles que se sintetizan, calcular (mediante un programa de hoja de cálculo como Microsoft Excel), el peso de polímero y reticulante necesario. Debido a que un determinado peso de polímero debe ser disuelto en un volumen definido total para lograr la concentración deseada en los hidrogeles, reticulante y porciones de solución de polímero del volumen total de gel también se debe determinar utilizando la hoja de cálculo. Cálculos similares se hicieron en su caso fracciones de suspensión (por ejemplo, un adhesivo que contiene RGD o YGSR oligopéptido) se incorporarán antes de la reticulación. </li><li> Pesar la cantidad necesaria de polímero y agente de reticulación y el lugar en tubos Eppendorf. Ajuste la hoja de cálculo para el cálculo de acuerdo al peso real de polímero obtenido. (Nota: el volumen puede ser alterado para compensar la masa real de polímero y reticulante obtenida). </li><li> Preparar los moldes de gel usando una cuchilla de afeitar para cortar la parte superior fuera de la envueltos individualmente estéril jeringas de 1 ml desechables. Garantizar un corte plano se hace para los moldes que se utilizarán para geles photopatterned. </li><li> Colocar los moldes de la jeringa, tubos Eppendorf (con las tapas abiertas) y cualquier otro material necesario por debajo de una fuente de luz germicida (por lo general construido en los gabinetes de seguridad biológica) y esterilizar durante 30 minutos. </li></ol> B. Preparación de la célula <ol><li> Después de la esterilización, añada el volumen adecuado de amortiguación estéril (por hojas de cálculo, mientras que la elección de buffer puede variar, PBS y un búfer de base débil como la trietanolamina se utilizan normalmente para la reticulación de los radicales libres y Michael tipo, respectivamente) a la Eppendorf polímero y (opcionalmente) colgante fracción que se incluirán (por ejemplo, el adhesivo péptido) y agitar para disolver (en caso de agitación fuera de la envoltura de la campana estéril Eppendorf con parafilm). </li><li> Añadir la cantidad apropiada de la solución fracción pendiente de la solución de polímero y envolver el sello con parafilm. Agitar brevemente e incubar a 37 ° C para reaccionar (si es posible, sobre una placa de agitación rotatorio) durante la preparación de la célula. Este consiste en la reacción de un tiol de un péptido (a través del grupo cisteína) a un acrilato o metacrilato para que el péptido se incluye como un grupo pendiente en el hidrogel final. </li><li> Trypsinize y el recuento de las células y se separan en porciones que contiene el número apropiado para cada conjunto de geles. Por ejemplo, para un conjunto de tres geles 50 l, con una densidad de 10 millones de células / ml, separadas 1,5 millones de células en un tubo cónico individual. Se recomienda que no más de 4 geles se prepararon en un conjunto individual debido a las fechas de gelificación (nota: si la síntesis de varios conjuntos de geles, una sola Eppendorf que contiene un volumen adecuado de solución de polímero para todos los conjuntos se pueden preparar). </li><li> Centrifugar las células. </li><li> Mientras que las células están girando hacia abajo <ol class="lalpha"><li> Luz inició entrecruzamiento de radicales libres: añadir un 0,5% en peso I2959 solución a la solución de polímero, igual al 10% del volumen de gel conjunto total (para una concentración final de iniciador% en peso de 0,05). </li><li> Michael tipo (además) la reticulación: añadir búfer en el entrecruzamiento de lograr la solución de concentración apropiada. </li><li> Para la reticulación secuencial: los geles incorporan ambos tipos de reticulación y requieren tanto de los pasos anteriores. </li></ol></li></ol> C. la formación del hidrogel <ol><li> Aspirar el sobrenadante de la porción celular se centrifuga. Espere a líquido para resolver después de la aspiración inicial y volver a aspirar a eliminar los medios de comunicación tanto como sea posible sin alterar el sedimento celular. </li><li> Resuspender el botón celular con la solución de polímero hasta que las células se distribuyen uniformemente. Minimizar la formación de burbujas en la solución de pipeta lentamente hacia arriba y abajo (aproximadamente 10 ciclos debe ser suficiente para distribuir las células). </li><li> Los hidrogeles reticulación <ol><li> Luz inició entrecruzamiento de los radicales libres: alícuotas el volumen adecuado en moldes punta de la jeringa. Exponer las jeringas a la luz UV para la reticulación radical (por ejemplo, una exposición de 10 minutos a 365 nm, 4 mW/cm2 de luz UV es común que los polímeros de acrilato funcionalizados). Este paso se debe realizar rápidamente para minimizar la célula resolver antes de exposición a la luz UV. </li><li> Michael tipo (además) la reticulación: se utiliza un orificio amplio punta de la pipeta, añada el volumen adecuado de solución de reticulante a la solución de polímero / celda, establezca la pipeta el volumen deseado gel individual, la solución de pipeta de arriba y abajo parahomogeneizar, y alícuota en los moldes punta de la jeringa. Este paso se debe realizar rápidamente para asegurar una distribución uniforme de las células. Permita 10-30 minutos (dependiendo del sistema individual) de incubación en el barrio de cultivo para la reticulación. </li><li> Reticulación secuencial: Consiste en la reacción de adición tipo Michael primero y luego la exposición a la luz durante la segunda reticulación. Sólo una fracción de enlaces cruzados teórico debe hacer reaccionar durante la reticulación y luego una máscara de estéril se debe aplicar directamente a la superficie del gel antes de la exposición a la luz con unas pinzas esterilizadas. Un tinte funcionalizados (rodamina por ejemplo, methacrylated (MeRho) a una concentración final en el gel de 20 nM) también se pueden añadir a la solución inicial para visualizar el patrón, ya que se incorporan preferentemente en las regiones radicalmente reticulada del gel (Figura 2 ). </li></ol></li></ol> D. cultivo celular y análisis <ol><li> Reticulación siguientes, geles sumergirse en pocillos de una placa de cultivo de tejido que contiene los medios de comunicación para la incubación y el análisis (consulte los pasos siguientes). </li><li> Las células se pueden visualizar la morfología con microscopía de luz (Figura 3; por lo general, los hidrogeles sintetizados son transparentes) y la viabilidad de uso de un fluorescente en vivo / muerto kit de tinción (Figuras 3 y 4). La tinción de actina celular (por ejemplo, rodamina o fluoresceína phalloidin) y núcleos (por ejemplo, 4&#39;-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) se puede realizar utilizando la fijación de estándares y procedimientos de permeabilización (Figura 4) con el siguiente procedimiento. <ol class="laplha"><li> Enjuague las construcciones 3X durante 5 minutos con PBS. </li><li> Fix geles de incubación en un ml de formaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague las construcciones 3X con solución de bloqueo que contiene 3% (w / v) BSA y 0,5% (w / v) en PBS Tween. </li><li> Permeabilizar la membrana con un 0,25% (w / v) de Triton X en solución de bloqueo durante 20 minutos. </li><li> Enjuague las construcciones 3X con solución de bloqueo. </li><li> Mancha de F-actina con 0,66 mg / ml FITC o rodamina phalloidin en solución de bloqueo durante dos horas a temperatura ambiente. </li><li> Enjuagar 3 veces con solución de bloqueo. </li><li> Tinción de los núcleos celulares con 0,4 l / ml DAPI en PBS durante 20 min. </li><li> Enjuagar 3 veces con PBS. </li><li> Visualizar las células mediante microscopía de epifluorescencia y confocal. </li></ol></li><li> Proliferación de las células dentro de los geles se suele evaluar mediante ensayos disponibles en el mercado (por ejemplo ADN, total o contenidos bioquímicos). PicoGreen es un uso común y sensible ácido nucleico mancha fluorescente para la cuantificación de ADN de doble cadena (Singer et al.). Las células también pueden ser contados y normalizado a un número de control inicial utilizando los métodos de visualización se describe en el Paso 2. </li><li> Corte histológico y la tinción también se puede utilizar para visualizar las células y la forma de la matriz. El siguiente protocolo para la deshidratación y la sección de los hidrogeles en 3D se puede utilizar para obtener secciones transversales en láminas de vidrio: <ol class="lalpha"><li> La fijación y la deshidratación <ol class="lroman"><li> Enjuague muestra 3X en PBS. </li><li> Arreglo para el 5 - 30 minutos en paraformaldehído al 4%. </li><li> Enjuague muestra 3X en PBS. </li><li> Incubar la muestra en EtOH a 25 ° C durante 1 hora a cada uno de los siguientes EtOH (v / v) las concentraciones en el agua (en orden): 50%, 70%, 95%, 95%, 100% (En este punto, las muestras se puede almacenar durante la noche a 25 ° C). </li></ol></li><li> Compensación y la infiltración <ol class="lroman"><li> Traslado al 100% Citrisolv durante 1 hora a 25 ° C, seguido por una hora a 65 ° C. </li><li> Cortar las muestras por la mitad con una cuchilla de afeitar en un plato de Petri de tal manera que la sección transversal de la muestra se expone. </li><li> Traslado a la mezcla 1:1 de Citrisolv / parafina Micro-corte de 1 hora a 65 ° C. </li><li> Traslado a la micro-corte de parafina 100% durante 1 hora a 65 ° C. </li><li> Traslado a la micro-corte de parafina 100% durante la noche a 65 ° C. </li><li> Traslado a la micro-corte de parafina 100% durante 1-2 horas a 65 ° C. </li></ol></li><li> Incrustación <ol class="lroman"><li> Posición ejemplar en desprendible del molde con el 100% de parafina. </li><li> Coloque una pequeña cantidad de cera en la cama del molde, e inserte las dos mitades de la muestra con la sección transversal hacia abajo. </li><li> Solicitar pieza superior del filtro <ol><li> Añadir más cera para sumergir la pieza superior y deje que endurezca durante ~ 10 minutos. </li></ol></li><li> Transferencia de inserta a 4 ° C refrigerador para permitir que muestra a endurecer toda la noche. </li><li> Las muestras pueden ser también la seccióned al día siguiente, por lo general con un espesor de 5.10 m por cada sector mediante micrótomos disponibles en el mercado. Normalmente el molde desprendible se monta en posición vertical en la etapa de microtomo, y los controles manuales se utilizan para establecer el espesor de corte, máquina de cortar y la alineación de la muestra con la hoja. </li></ol></li><li> La extracción de RNA La expresión de genes también pueden ser evaluados cuantitativamente (por ejemplo, a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). El protocolo para la extracción de RNA a partir de hidrogeles en 3D, un ejemplo de lo que figura a continuación, es muy diferente del caso mucho más simple en 2D. <ol class="lroman"><li> Etiqueta de un certificado libre de RNasa tubo Eppendorf para cada hidrogel 3D y añadir 500 l Trizol ® reactivo a cada tubo. </li><li> Use un mortero (triturador de tejidos) para moler manualmente los hidrogeles hasta que una solución se aclare. Molinillos de garantizar diferentes se utilizan para cada condición. </li><li> Vortex cada Eppendorf durante 20 segundos para homogeneizar las muestras. </li><li> Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína. </li><li> Enfriar las muestras en hielo durante 20 min </li><li> Añadir 200 l (por ml de Trizol) cloroformo a cada muestra y mezclar. </li><li> Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos. </li><li> Centrifugar las muestras a 12.000 xg a 4 ° C durante 15 min. </li><li> Pasar la fase acuosa (capa superior clara) a los nuevos tubos Eppendorf (evitando la región interfacial y la fase inferior de color rojo, de fenol-cloroformo). ARN permanece en la fase acuosa clara. </li><li> Las técnicas más comunes para el aislamiento de ARN y el almacenamiento se puede utilizar ahora. </li><li> Tras la extracción de ARN, los kits disponibles en el mercado de la transcriptasa inversa y PCR en tiempo real a menudo se utilizan con algunas modificaciones (Elisseff et al. Strehin et al.). </li></ol></li></ol></li></ol> Los resultados representativos: Vea las figuras 2.4 (como se indica en los protocolos anteriores) para obtener resultados representativos de la visualización de los hidrogeles photopatterned y la encapsulación de células dentro de los geles. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig1_2.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Descripción del procedimiento de encapsulación en 3D. Pasos diagrama corresponden a los títulos de los protocolos de paso a paso. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Photopatterned hidrogel con secuencial tipo Michael polimerización entonces radical. (A) Esquema de photopatterning de un hidrogel reticulado parcialmente con la incorporación de un colorante reactivo foto. (B) o Círculo (C) la transparencia de banda máscara de la película con dibujos hidrogeles de ácido hialurónico. Rodamina Methacrylated (MeRho) se ha incorporado sólo en las regiones del gel que se expone a la luz. Las barras de escala = 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Visualización de las células en hidrogel 3D. Las células madre visualizada a través de (a) o microscopía de luz (b) vivir (verde, calceína AM) y muertos (rojo, homodímero de etidio-1) tinción 24 horas después de la encapsulación en 1 millón de células / ml en un hidrogel de ácido hialurónico reticulado a través de una luz iniciado mecanismo de radicales libres. Las barras de escala = 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/1590/1590fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Visualización de las células en hidrogel 3D. hMSCs teñidos para (a) las células vivas (calceína AM) o (b) celular de actina (rodamina phalloidin) y núcleos (DAPI) cinco días después de la encapsulación en 1 millón de células / ml en un hidrogel de ácido hialurónico reticulado a través de un mecanismo de tipo Michael ( la utilización de péptidos colgante adhesivo y reticulantes bifuncionales péptido proteolíticamente degradable). Las barras de escala = 100 micras.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Anal Biochem. 249, 228-238 (1997).</li><li>Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Responsive+Synthetic+Hydrogels.">Cell-Responsive Synthetic Hydrogels.</a> Adv Mater. 15, 888-892 (2003).</li><li>Elisseeff, J. H., Ruffner, M., Kim, T. G., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Photoencapsulation+in+Hydrogels.">Cellular Photoencapsulation in Hydrogels.</a> Culture of Cells for Tissue Engineering. , (2006).</li><li>Chung, C., Mesa, J., Miller, G. J., Randolph, M. A., Gill, T. J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+auricular+chondrocyte+expansion+on+neocartilage+formation+in+photocrosslinked+hyaluronic+acid+networks.">Effects of auricular chondrocyte expansion on neocartilage formation in photocrosslinked hyaluronic acid networks.</a> Tissue Eng. 12, 2665-2773 (2006).</li><li>Burdick, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+microenvironments+for+controlled+stem+cell+differentiation.">Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 205-219 (2008).</li><li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+Mode+Thiol-Acrylate+Photopolymerization+for+the+Synthesis+of+PEG-Peptide+Hydrogels.">Mixed Mode Thiol-Acrylate Photopolymerization for the Synthesis of PEG-Peptide Hydrogels.</a> Macromolecules. 41, 6019-6026 (2008).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., Zammaretti, P., Hubbell, J. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-responsive+hydrogel+for+encapsulation+of+vascular+cells.">Cell-responsive hydrogel for encapsulation of vascular cells.</a> Biomaterials. 30, 4318-4324 (2009).</li><li>Strehin, I. A., Elisseeff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+ECM+Production+by+Cells+Encapsulated+in+Hydrogels.">Characterizing ECM Production by Cells Encapsulated in Hydrogels.</a> Methods Mol Biol. 522, 1-14 (2009).</li><li>Khetan, S., Katz, J. S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+crosslinking+to+control+cellular+spreading+in+3-dimensional+hydrogels.">Sequential crosslinking to control cellular spreading in 3-dimensional hydrogels.</a> Soft Matter. 5, 1601-1606 (2009).</li></ol>

Los protocolos descritos representan un método simple y poderoso para encapsular las células en andamiajes de hidrogel de manera citocompatible. Estas técnicas son especialmente importantes desde terminales diferenciadas y las células madre pueden mostrar un comportamiento marcadamente diferente en 2D versus 3D microambientes. Incluso los enfoques terapéuticos que implican la implantación de materiales (por ejemplo, polimerización in situ radical), la encapsulación de células y el análisis de la viabilidad y la diferenciación puede ayudar en el proceso de desarrollo material. El proceso descrito secuencial puede ser usado para manipular el entorno espacial de hidrogel, y en consecuencia el comportamiento celular (ver Khetan et al.). En general, el elemento más crítico de los protocolos descritos es la homogeneidad de todas las soluciones que se utilizan. En particular, la atención especial se debe tomar para asegurarse de células se distribuyen uniformemente en la solución de prepolímero, y que la solución se mezcla bien por la resuspensión de pipeta después de la adición de la solución de reticulante. No asegurarse de que esto puede conducir a la aglutinación de las células o las variaciones locales en la estructura del gel y la hinchazón. Mientras que los protocolos que aquí se presenta se centran principalmente en el procedimiento para la encapsulación de células, es importante tener en cuenta también que la encapsulación puede requerir algunos ajustes a los protocolos de análisis que suelen ser por escrito para la siembra en 2D. Varios ejemplos se ilustra para la visualización y evaluación de las células en hidrogel.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.2 M Triethanolamine Buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0449</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14040-117</td>
<td>1x, sterile liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead staining kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Includes live (Calcein AM) and dead (ethidium homodimer-1) probes</td>
</tr>
<tr>
<td>Phalloidin-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine Phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>R415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D9542</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Citrisolv</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-143975</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-cut paraffin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>24202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizol reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.22 &mu;m pore size nylon syringe filters</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>09-719C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 mL disposable syringes</td>
<td>Equipment</td>
<td>BD biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>Cut syringes at consistent height for UV exposure</td>
</tr>
<tr>
<td>Wide orifice pipette tips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with 365 nm filter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>254 nm germicidal UV light source</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Built into most biological safety cabinets</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

cellular encapsulation in 3d hydrogels for tissue engineering 

La encapsulación en 3D de las células dentro de los hidrogeles representa una técnica cada vez más importante y popular para el cultivo de células y en el desarrollo de las construcciones de ingeniería de tejidos. Este entorno mejor imita lo que observamos en las células in vivo, en comparación con el cultivo de tejidos estándar, debido a las propiedades como el tejido y el medio ambiente 3D. Hidrogeles poliméricos sintéticos son agua hinchada redes que pueden ser diseñados para ser estables ni degradar a través de la hidrólisis o proteólisis de nuevo tejido se deposita en las células encapsuladas. Una amplia variedad de polímeros se han explorado para estas aplicaciones, tales como poli (etilenglicol) y el ácido hialurónico. Por lo general, el polímero es funcionalizado con grupos reactivos, tales como metacrilatos o acrilatos capaz de sufrir entrecruzamiento través de diversos mecanismos. En la última década, el progreso se ha hecho mucho en la ingeniería de estos microambientes - por ejemplo, a través de la incorporación covalente física o pendiente de las señales bioquímicas - para mejorar la viabilidad y el fenotipo celular directa, incluyendo la diferenciación de las células madre encapsulado (Burdick et al.). Los siguientes métodos para la encapsulación de células en 3D se han optimizado en nuestros laboratorios y otros para maximizar cytocompatibility y minimizar el número de pasos de procesamiento de hidrogel. En los siguientes protocolos (ver Figura 1 para ver una ilustración del procedimiento), se asume que los polímeros funcionalizados capaz de sufrir entrecruzamiento ya están en la mano, excelentes críticas de la química de los polímeros que se aplican al campo de la ingeniería de tejidos se pueden encontrar en otros lugares (Burdick et al.) y los métodos que sean compatibles con una amplia gama de tipos de polímeros. Además, la adición tipo Michael (ver Lütolf et al.) Y la iniciada por la luz de los radicales libres (ver Elisseeff et al.) Se centró en los mecanismos de aquí constituyen sólo una pequeña parte de las técnicas de reticulación informó. Entrecruzamiento de modo mixto, en el que por primera vez una parte de los grupos reactivos consumidos por entrecruzamiento de suma y seguido por un mecanismo de radicales, es otro paradigma de uso común y de gran alcance para dirigir el fenotipo de las células encapsuladas (Khetan et al., Salinas et al.).

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering at JoVE.com

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

cellular-encapsulation-in-3d-hydrogels-for-tissue-engineering

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

36.8K vistas.  University of Pennsylvania. Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

Video: Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Métodos experimentales para la Ingeniería de Tejidos

Investigación

Biología

Title Cell Encapsulation by Droplets

Título encapsulación celular a través de gotitas

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning andamios fibroso polímero para ingeniería de tejidos y cultivos celulares

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these models utilize reconstituted basement membrane derived from animals which contain a variable amount of growth factors and cytokines that can influence the growth of these cell culture models. Here, we describe in detail the preparation and use of PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel that is devoid of animal-derived material and pathogens to encapsulate and propagate the ovarian cancer cell line, OVCAR-5. We begin by describing how to prepare the PuraMatrix prior to use. Next, we demonstrate how to properly mix the PuraMatrix and cell suspension to encapsulate the cells in the hydrogel. Upon the addition of cell culture media or injection into a physiological environment, the peptide component of PuraMatrix rapidly self assembles into a 3D hydrogel that exhibits a nanometer scale fibrous structure with an average pore size of 5-200 nm1. In addition, we demonstrate how to propagate cultures grown in encapsulated PuraMatrix. When encapsulated in PuraMatrix, OVCAR-5 cells assemble into three dimensional acinar structures that more closely resemble the morphology of micrometastatic nodules observed in the clinic than monolayer in vitro models. Using confocal microscopy we illustrate the appearance of representative OVCAR-5 cells encapsulated in PuraMatrix on day 1, 3, 5, and 7 post plating. The use of PuraMatrix to culture cancer cells should improve our understanding of the disease and allow us to assess treatment response in more clinically predictive model systems.

This video demonstrates how to encapsulate and culture cancer cells in PuraMatrix, a commercially available self assembling peptide gel.

PuraMatrix encapsulación de las células cancerosas

Increasing evidence suggests that culturing cancer cells in three dimensions more accurately recapitulates the complexity of tumor biology. Many of these ...

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un sistema 3D para los condrocitos articulares humanos cultivo de líquido sinovial

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy this deficiency, several medical interventions have been developed. One such method is to resurface the damaged area with tissue-engineered cartilage; however, the engineered tissue typically lacks the biochemical properties and durability of native cartilage, questioning its long-term survivability. This limits the application of cartilage tissue engineering to the repair of small focal defects, relying on the surrounding tissue to protect the implanted material. To improve the properties of the developed tissue, mechanical stimulation is a popular method utilized to enhance the synthesis of cartilaginous extracellular matrix as well as the resultant mechanical properties of the engineered tissue. Mechanical stimulation applies forces to the tissue constructs analogous to those experienced in vivo. This is based on the premise that the mechanical environment, in part, regulates the development and maintenance of native tissue1,2. The most commonly applied form of mechanical stimulation in cartilage tissue engineering is dynamic compression at physiologic strains of approximately 5-20% at a frequency of 1 Hz1,3. Several studies have investigated the effects of dynamic compression and have shown it to have a positive effect on chondrocyte metabolism and biosynthesis, ultimately affecting the functional properties of the developed tissue4-8. In this paper, we illustrate the method to mechanically stimulate chondrocyte-agarose hydrogel constructs under dynamic compression and analyze changes in biosynthesis through biochemical and radioisotope assays. This method can also be readily modified to assess any potentially induced changes in cellular response as a result of mechanical stimuli.

The biosynthesis of cartilaginous extracellular matrix by chondrocytes can be affected by application of mechanical stimuli. This method describes the technique of applying dynamic compressive strains to chondrocytes encapsulated in 3D constructs and the evaluation of induced changes in chondrocyte metabolism.

La estimulación mecánica de condrocitos-agarosa hidrogeles

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...