NINDS subvenciones NS49720 y NS65819 y NCI subvención CA97257

1. Preparación de las células tumorales. Las células de xenoinjertos de tumores cerebrales pueden ser originados por tumores propaga como tumores subcutáneos en ratones atímicos, o de cultivos celulares. La utilización de ambas fuentes de células se discute a continuación, junto con la demostración de un método para la implantación de células. Para preparar las células de tumores subcutáneos para la transferencia en el compartimento intracraneal, tumores extirpados flanco se colocan en placas de cultivo, donde el tejido es inicialmente picada con un bisturí y luego interrumpido mecánicamente por pipeteo repetitivo para crear una suspensión total de la celda 1. La suspensión total de la célula se hace pasar por una malla de nylon 70 M de filtros para producir una suspensión de células individuales para inyección intracraneal. La suspensión celular se centrifuga a 1000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C, y el sobrenadante aspirado antes de resuspender el pellet de células en un volumen apropiado de medio libre de suero para obtener una concentración de trabajo final (ver más abajo). Para la preparación de líneas celulares establecidas para la implantación intracraneal, se cosechan las células por monocapas trypsinizing, o mediante la recopilación de las culturas neuroesfera suspensión, la centrifugación y resuspensión de las células como se ha indicado 2. El número de células inyectadas es variable dependiente de la localización neuroanatómica de la inyección. Para las inyecciones supratentorial que habitualmente se inyectan 5.3 x 10 5 células en 3 L de medio libre de suero (DMEM), mientras que para las inyecciones de tronco cerebral 3, tan sólo 5 x 10 4 células se inyectan en 0,5 mL. Inyección de grandes volúmenes de lo recomendado puede provocar el reflujo de las células tumorales a través del trayecto de la aguja, con exofítico resultante (Figura 1), en lugar de crecimiento de los tumores intracraneales. Después de retirarse de la muestra para la inyección intracraneal, la suspensión de células restantes deben ser colocados en hielo, con el contenido puede mezclarse con frecuencia para mantener la concentración adecuada al completar el establecimiento del tumor intracraneal entre los miembros de una serie de inyecciones. 2. Implantación de células tumorales Tenga en cuenta que todos los procedimientos que se describen a continuación han sido revisados ​​y aprobados por el Uso de Animales institucional y el cuidado en la Universidad de California en San Francisco. <ol><li> El área quirúrgica debe estar preparado rociando todas las superficies con un desinfectante, como la solución de clorhexidina al 2%. Después de usar el desinfectante, los siguientes materiales deben ser colocados en el área quirúrgica: <ul><li> Almohadilla eléctrica para mantener la temperatura del cuerpo del ratón </li><li> Dos pequeñas cápsulas de Petri, que contiene 3% de peróxido de hidrógeno, y otro que contiene clorhexidina al 2% </li><li> Hisopos estériles de gasa y algodón </li><li> Bisturís estériles desechables </li><li> Grapadora quirúrgica autoclave </li></ul></li><li> Para la anestesia de una inyección de anestesia se debe utilizar, por lo general una mezcla de ketamina-xilazina. </li><li> Una vez que un ratón es anestesiado, el cuero cabelludo se prepara limpiando varias veces con un trozo de gasa estéril empapado en la solución de clorhexidina. Pomada para los ojos se deben aplicar para mantener la humedad adecuada durante el procedimiento. Con un bisturí estéril, realizar una incisión sagital sobre el hueso parieto-occipital, aproximadamente 1 cm de largo. La superficie del cráneo expuesta se limpia con un algodón empapado en una solución de peróxido de hidrógeno al 3%. El bregma debe ser evidente en este punto (ver video). </li><li> Las coordenadas para la inyección de las células tumorales puede variar de acuerdo con el sitio deseado para el establecimiento del tumor. A continuación figura el procedimiento que usamos para el establecimiento del tumor intracerebral 2 en una localización neuroanatómica en el que muchos pacientes con tumores cerebrales experiencia en el desarrollo del tumor. Otros lugares de interés en la investigación de tumores cerebrales incluyen el puente, para el modelado anatómico del tallo cerebral tumores 3, y las inyecciones subdural para el modelado de la ubicación de los tumores meníngeos 4. Antes de la inyección de células tumorales, utilice una aguja de calibre 25 estéril afilado para perforar el cráneo de 2 mm a la derecha del bregma y 1 mm por delante de la sutura coronal, creando una apertura para la inyección de células tumorales (ver video). Este procedimiento funciona bien tanto para los ratones y las ratas (22 aguja de calibre para las ratas). </li><li> Antes de recurrir las células dentro de la jeringa, mezclar el contenido de la suspensión celular golpeando con el dedo. Cargue la jeringa con la cantidad deseada de suspensión celular, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas de aire. El exterior de la jeringa luego se deben limpiar con una gasa con alcohol para limpiar el exterior libre de células adherentes, lo que ayudará a prevenir el establecimiento y el crecimiento del tumor extracraneal (Figura 1). Para asegurarse de que la profundidad de la inyección adecuada es importante utilizar un bisturí para cortar de 3 mm de la punta de una punta de P20 pipetteman. En esta sección de la punta se puede montar sobre la jeringa y actuará para limitar la profundidad de la inyección, y se asegurará, además, que el tip de la aguja de la jeringa es de 3 mm de la parte inferior del cráneo. Coloque la jeringa perpendicular al cráneo y en el agujero creado con anterioridad, e inyecte lentamente la suspensión de células (una suspensión 3μL debe inyectarse en un período de 1 minuto). Un ángulo inadecuado de la inserción puede resultar en una jeringa de inyección intraventricular de las células y su posterior difusión espinal (Fig. 1B: Derecha) Al término de la inyección, deje la aguja en su lugar por un minuto, luego retire lentamente (ver video): estos pasos le ayudará a reducir reflujo de las células tumorales. </li><li> Como una alternativa al enfoque sin ayuda o sin mano de la implantación de células tumorales intracraneales 5, se puede utilizar un marco estereotáxico animales pequeños (F panel de visión esquemática), que generalmente promueve la ubicación de la inyección más consistente, pero a costa de grandes cantidades de tiempo de procedimiento. En nuestra experiencia, dos miembros del personal quirúrgico puede inyectar hasta 60 ratones / hora cuando se utiliza el enfoque a mano, mientras que la tasa máxima de inyección con un marco estereotáxico pequeños animales es de aproximadamente 15 ratones / hora. La conveniencia de procedimiento es una consideración importante cuando se inyectan grandes series de los ratones, y ayuda a reducir el tiempo en que las células tumorales, que se inyecta, se dejan en el hielo. </li><li> Limpia el cráneo con el peróxido de hidrógeno al 3% y secar con un hisopo de algodón estéril seca. Aplicar cera de hueso estéril en el orificio. Con una pinza, sacar el cuero cabelludo junto a la calavera y grapas para cerrar. Para una cicatrización óptima, el cuero cabelludo debe grapar con la dermis de cada lado del cuero cabelludo contra la otra (parte inferior contra la parte inferior). El cuero cabelludo con grapas deben limpiarse con solución de clorhexidina, y la buprenorfina se administra por inyección subcutánea para el alivio del dolor post-operatorio. </li><li> Controlar todos los ratones después de la operación hasta que se ambulantes y mantener la actividad normal. Por lo general, el tiempo de recuperación es de alrededor de 30 minutos. </li></ol> 3. Bioluminiscencia control del crecimiento tumoral <ol><li> De fondo. Imágenes de bioluminiscencia (BLI) se basa en la oxidación de la luciferina [d-(-) -2 - (60-hidroxi-20-benzotiazolilo)-thiazone-4-carboxílico] en presencia de oxígeno y el trifosfato de adenosina (ATP). Esta reacción es catalizada por la enzima luciferasa, que convierte la energía química en fotones con la emisión resultante de la luz. Las células humanas pueden ser modificados para expresar la luciferasa (ver más abajo), y sólo las células que expresan luciferasa capaz de emitir luz en presencia del sustrato luciferina. No es la luminiscencia de fondo mínimo de los animales tratados con luciferina anfitriones, de tal manera que hay una muy favorable relación señal-ruido para la detección de las emisiones de luminiscencia de la luciferasa modificado las células tumorales, permite un seguimiento muy sensible del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento in vivo. Por otra parte, la luciferasa y su sustrato, la luciferina, se ha demostrado que no es tóxico para las células de mamíferos, y no hemos encontrado diferencias funcionales entre las células que expresan luciferasa relativa a las células correspondientes modificaciones. Luciferina atraviesa fácilmente las membranas celulares y la barrera sanguínea del cerebro después de la intraperitoneal (ip) o intravenosa (iv) la inyección en ratones, lo que permite imágenes de cada compartimento que contiene luciferasa modificados células. El nivel de emisión de fotones y el espectro de luz emitido por la luciferasa modificados células es suficiente para penetrar en los tejidos de los animales de investigación pequeños, como ratones y ratas, y se puede detectar el exterior con cámaras de imagen con poca luz. La naturaleza no invasiva de imágenes de bioluminiscencia permite la monitorización repetida del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento en pacientes individuales de los animales. </li><li> Fuentes de células implantadas deben ser modificados de forma estable para la expresión de luciferasa de luciérnaga. Estas fuentes de células se pueden comprar o se han producido en los laboratorios individuales mediante lentivirus que se han construido para la expresión constitutiva de la luciferasa. Se recomienda encarecidamente el uso de células modificadas con lentivirus que codifica la luciferasa, en lugar de plásmido, para asegurar la expresión estable de la luciferasa celulares in vivo, lo cual es necesario para obtener imágenes de luminiscencia cuantitativas para proporcionar una indicación precisa de los cambios en la carga tumoral de los sujetos individuales de los animales que se repiten reflejado en el transcurso de un experimento. </li><li> BLI control. Recomendamos la realización de imágenes de bioluminiscencia cuantitativa (qBLI) 1x-2x por semana, comenzando una semana después de la inyección de células tumorales. Nuestra qBLI se lleva a cabo utilizando el IVIS Lumina imágenes estación (Caliper Life Sciences), y nuestros resultados indican datos similares se obtienen en el uso del Lumina IVIS, el IVIS 150, o la estación de IVIS 200 imágenes. En preparación para las imágenes, los ratones son a la vez anestesiados con ketamina / xilazina y administrado luciferina (D-luciferina sal de potasio, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences) mediante inyección intraperitoneal, con ratones imágenes 12 minutos después de la inyección. La farmacocinética de la luciferina indican que el tiempo entre la administracióntración de la luciferina y la determinación de la luminiscencia celular debe estar entre 10-15 minutos después de la inyección de la luciferina, a fin de obtener el máximo de emisión de luminiscencia y la mayor sensibilidad de detección. El período de tiempo seleccionado en el intervalo de 10-15 minutos de tiempo se debe mantener lo más constante entre los animales que se va a examinar. Es de suma importancia para mantener la consistencia en la longitud de tiempo entre la inyección de luciferina y la obtención de lecturas de BLI. Las regiones de interés que abarcan la zona intracraneal de la señal se definen mediante el software de vida de la imagen (Figura 2), y el photons/s/sr/cm2 total (fotones por segundo por estereorradián por centímetro cuadrado) se registran (ver video). </li><li> Análisis de datos. Mientras que el crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento se controlan en los animales, le recomendamos los grupos de tratamiento de al menos 8 para aumentar la certeza estadística de conclusiones sobre la respuesta del tumor, o falta de ella, a la terapia. Con respecto a la presentación de los resultados qBLI, las lecturas de luminiscencia se convierten en valores normalizados dividiendo luminiscencia cada ratón s, obtenidos durante y posterior a la finalización del régimen terapéutico, con su correspondiente tratamiento previo luminiscencia máxima de lectura 6,7. Para el análisis de la supervivencia, el estimador de Kaplan-Meier 8 se utiliza, y de la cual las curvas de supervivencia se generan, y determinar los valores de la mediana de supervivencia. Las diferencias entre las curvas de supervivencia se compararon mediante una prueba de log-rank 9. </li><li> Recuperación del cerebro para su posterior análisis de tumor tratado y no tratado. Sobre la eutanasia de los animales, el cerebro del ratón debe ser rápidamente eliminado (ver video), y, o bien colocado en formalina para su posterior análisis de la morfología del tumor y la inmunohistoquímica, o debe ser montado en octubre para la congelación de la muestra. </li></ol> 4. Resultados representante En el ejemplo que se muestra en la Figura 3A, los ratones que recibieron inyecciones de células tumorales intracraneales fueron controlados por luminiscencia intracraneal hasta que los sucesivos valores de luminiscencia significa que señalan un crecimiento progresivo del tumor, y en el que se inició la terapia de tiempo (a partir de la flecha gris en el día 34: erlotinib administrado diariamente a 150 mg / kg hasta que la eutanasia es necesario). Los valores de luminiscencia para cada ratón se establece en un valor normalizado de una en el momento de iniciar el tratamiento, con las lecturas de luminiscencia posterior de cada ratón normalizado a su valor final de imagen antes del tratamiento. A modo de ejemplo, un ratón con una lectura de luminiscencia final pre-tratamiento de 2,0 x 10 7 fotones / seg en el día 34, cuya luminosidad se había incrementado a 6.0 x 10 7 fotones / seg en el día 38, tendría un valor de luminosidad día 38 normalizado de 3,0. La media de la bioluminiscencia normalizado y el error estándar correspondiente para el control de los grupos de tratamiento y se trazan para cada punto de la imagen en tiempo. En este ejemplo, una diferencia significativa en la luminiscencia normalizada promedio es evidente en el punto de imagen por primera vez con posterioridad al inicio del tratamiento (día 38), con la diferencia de luminosidad media del grupo que muestran un aumento más en los tiempos posteriores. En la mayoría de los casos, la actividad antitumoral de la terapia, según lo indicado por qBLI, está acompañada por una correspondiente diferencia significativa en la supervivencia (es decir, p &lt;0,05), como es el caso aquí (Figura 3B). Paneles 3C y 3D muestran adyacentes hematoxilina y eosina y anti-EGFR secciones teñidas de cerebro de ratón obtenido en el momento de la eutanasia, después de la colocación del cerebro resecado en formalina y posterior inclusión en parafina para el corte. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Indicaciones de errores de inyección intracraneal. A) exofítico (extracraneal) el crecimiento del tumor (círculo rojo) puede ser causada por muy grande un volumen de inyección, suspensión de células residuales unido a la jeringa, o de retirar la jeringa con demasiada rapidez después de la inyección de las células tumorales. B) Inyección de células tumorales en los ventrículos puede causar la difusión de la columna vertebral del tumor (ratón hacia la derecha), en contraste con las células tumorales inyectadas correctamente, la señal para que se queda localizado en el sitio de inyección (ratón hacia la izquierda). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Calor representaciones de mapas de imagen de la intensidad de la bioluminiscencia de los ratones representante de control (izquierda) y tratamiento (derecha), los grupos de un experimento de la respuesta al tratamiento. El software de imagen viva se puede configurar para definir las regiones de interés (círculos rojos), u operadores del instrumento se pueden definir las regiones de interés de forma manual. Para el uso de imágenes como estas para la construcción de la figura, se recomienda que el operador del instrumento muestra imágenes de mapas de calor con el mismo calor bioluminiscencia de Gama (parte superior de la figura), para proporcionar una representación visual de la magnitud de la diferencia entre los sujetos bioluminiscencia animal. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt = &quot;Figura 3&quot; /&gt; Figura 3. Bioluminiscencia, la supervivencia y el análisis de tejido tumoral de un experimento en el que la respuesta terapéutica es evidente. Un gráfico) de las lecturas de la bioluminiscencia significa para el control y tratamiento de los ratones del grupo, con un error estándar indicado para cada punto de imagen. B) Representar la supervivencia de los ratones mismo p-valor determinado mediante el uso de la prueba de log-rank 7. C) H &amp; E manchadas sección del cerebro de los ratones con tumor. D) EGFR manchado sección. E y F) Aumentos de las áreas indicadas de los paneles C y D, respectivamente, con E panel que muestra tinción negativa para tumor supresor de proteína PTEN.

<ol>
	<li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM.">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li><li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats.">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li><li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging.">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , (2009).</li><li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma.">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li><li>Ozawa, T., James, C. D., Van Meir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Brain+Tumor+Cell+and+Tumor+Tissue+Transplantation+Models.">Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models.</a> CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches. , 147-162 (2009).</li><li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel.">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li><li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy.">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li><li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations.">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li><li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures.">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li><li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression:+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions.">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li></ol>

Ortotópico (intracraneal) tumor cerebral establecimiento xenoinjerto proporciona un microambiente adecuado para el desarrollo de cáncer 10 CNS a hacerse la prueba de la respuesta terapéutica. Este tipo de modelo, además, proporciona información sobre el acceso terapéutico al cerebro y el tumor cerebral, que es de importancia crítica para determinar si un agente experimental se debe avanzar a la evaluación de ensayos clínicos en pacientes. Debido a la cantidad de xenoinjerto de tumor intracraneal no se puede medir directamente, por ejemplo, pinzas, el seguimiento longitudinal de crecimiento de los tumores intracraneales y respuesta al tratamiento requiere de imagen no invasivas, con nuestra experiencia de formación de imágenes de bioluminiscencia que indica que el enfoque más práctico para los experimentos cuyo objetivo primordial está evaluando el alcance de la respuesta del tumor a la terapia. Cuando los resultados de las imágenes de bioluminiscencia se combinan con el análisis de supervivencia de los animales sujetos, los dos conjuntos de datos proporcionan un enfoque poderoso y confiable para evaluar la eficacia terapéutica experimental. Por último, es de suma importancia que los xenoinjertos de tumores intracraneales del cerebro se cosechan a partir de materias animales sacrificados con el fin de evaluar los efectos morfológicos y moleculares de la terapia, y para ello prefiere la resección de todo el cerebro en el momento de la eutanasia, con la preservación del cerebro resecado para su posterior análisis. Considerando que la presentación anterior se ha concretado a la investigación de tumores cerebrales, los conceptos son sin duda generalizables a otros tipos de cáncer humano que son susceptibles de modelado ortotópico en los roedores.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Disposable Scapels</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975</td>
			<td>No.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dunlap</td>
			<td>HP950</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22028563</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Chlorhexidine</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9756995</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen Peroxide</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H312P-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25g Needle</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Hamilton Sharp Microsyringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>20734</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Stapler and Staples</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>59020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Frame</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Stoeling</td>
			<td>51725</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td>Potassium Salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen Lumina</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Caliper Life Science</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging

Modelos de trasplante con células humanas de tumor en el cerebro han servido una función esencial en la investigación neuro-oncología por muchos años. En el pasado, el procedimiento más utilizado para el establecimiento humano xenoinjerto de tumor consistió en la recolección de las células de los frascos de cultivo, seguida de la inyección subcutánea de las células recogidas en ratones inmunodeprimidos. Considerando que este enfoque todavía ve el uso frecuente en muchos laboratorios, ha habido un cambio significativo en el énfasis en la última década hacia el establecimiento de xenoinjertos ortotópico, que, en el caso de los tumores cerebrales, requiere de la inyección de células tumorales en las adecuadas estructuras neuroanatómicas. Debido a que el establecimiento de xenoinjerto intracraneal elimina la posibilidad de controlar el crecimiento del tumor a través de la medición directa, como por el uso de pinzas, el cambio de énfasis hacia los modelos de xenoinjerto de tumor cerebral ortotópico ha requerido la utilización de imagen no invasivas para la evaluación de la carga tumoral en los animales huéspedes. De los métodos de imagen disponibles en la actualidad, la supervisión de bioluminiscencia se considera generalmente ofrecen la mejor combinación de sensibilidad, conveniencia y costo. Aquí, vamos a demostrar los procedimientos para el establecimiento ortotópico tumor cerebral, y para vigilar el crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento cuando se prueban tratamientos experimentales.

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Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cerebrales.

El establecimiento de xenoinjertos de tumor cerebral intracraneal, con posterior análisis del crecimiento tumoral y respuesta al tratamiento con imágenes de bioluminiscencia

Transplantation models using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research for many years. In the past, the most ...

establishing-intracranial-brain-tumor-xenografts-with-subsequent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

39.0K vistas.  University of California, San Francisco - UCSF. Luciferasa modificados xenoinjertos de tumores humanos el cerebro puede ser establecida por vía intracraneal en ratones atímicos, con posterior seguimiento del crecimiento del tumor y la respuesta a la terapia que utiliza imágenes de bioluminiscencia. En combinación con el análisis de supervivencia, la supervisión de bioluminiscencia es una herramienta esencial para la investigación pre-clínica de las terapias que se consideran para el tratamiento de tumores cereb...

Video: Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

La investigación del cerebro de imagen del efecto perjudicial de la emoción sobre la cognición

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Investigación

Neurociencias

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments in vision research require displays with more than 12 bits of luminance resolution. Several solutions are available. Bit++ 1 and DataPixx 2 use the Digital Visual Interface (DVI) output from graphics cards and high resolution (14 or 16-bit) digital-to-analog converters to drive analog display devices. The VideoSwitcher 3 described here combines analog video signals from the red and blue channels of graphics cards with different weights using a passive resister network 4 and an active circuit to deliver identical video signals to the three channels of color monitors. The method provides an inexpensive way to enable high-resolution monochromatic displays using conventional graphics cards and analog monitors. It can also provide trigger signals that can be used to mark stimulus onsets, making it easy to synchronize visual displays with physiological recordings or response time measurements.
Although computer keyboards and mice are frequently used in measuring response times (RT), the accuracy of these measurements is quite low. The RTbox is a specialized hardware and software solution for accurate RT measurements. Connected to the host computer through a USB connection, the driver of the RTbox is compatible with all conventional operating systems. It uses a microprocessor and high-resolution clock to record the identities and timing of button events, which are buffered until the host computer retrieves them. The recorded button events are not affected by potential timing uncertainties or biases associated with data transmission and processing in the host computer. The asynchronous storage greatly simplifies the design of user programs. Several methods are available to synchronize the clocks of the RTbox and the host computer. The RTbox can also receive external triggers and be used to measure RT with respect to external events. 
Both VideoSwitcher and RTbox are available for users to purchase. The relevant information and many demonstration programs can be found at <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a>.

Conventional computer hardware can not generate visual stimuli with sufficiently high grayscale resolution and measure response times with sufficient accuracy. We describe how to use the VideoSwitcher to produce high-resolution monochromatic displays, and the RTbox to measure response times with high accuracy on conventional computer hardware.

Habilitación de alta resolución en escala de grises Muestra y medidas precisas de tiempo de respuesta en los ordenadores convencionales

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in glioblastoma mutliforme (GBM), is to identify and isolate tumor initiating cell population(s) to investigate their role in tumor formation, progression, and recurrence. Understanding tumor initiating cell populations will provide clues to finding effective therapeutic approaches for these tumors. The neurosphere assay (NSA) due to its simplicity and reproducibility has been used as the method of choice for isolation and propagation of many of this tumor cells. This protocol demonstrates the neurosphere culture method to isolate and expand stem-like cells in surgically resected human GBM tumor tissue. The procedures include an initial chemical digestion and mechanical dissociation of tumor tissue, and subsequently plating the resulting single cell suspension in NSA culture. After 7-10 days, primary neurospheres of 150-200 &mu;m in diameter can be observed and are ready for further passaging and expansion.

This video protocol demonstrates the isolation and expansion of stem like cells from surgically resected human glioblastoma mutliforme (GBM) tumor tissue using the neurosphere assay culture method.

El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

Stem-like cells have been isolated in tumors such as breast, lung, colon, prostate and brain. A critical issue in all these tumors, especially in ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-análisis de la estructura y función cerebral mediante resonancia magnética funcional y la difusión de imágenes ponderado

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Kinematic Analysis Using 3D Motion Capture of Drinking Task in People With and Without Upper-extremity Impairments

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion capture with an optoelectronic camera system is considered as golden standard for kinematic movement analysis and is increasingly used as outcome measure to evaluate the movement performance and quality after an injury or disease involving upper extremity movements. This article describes a standardized protocol for kinematic analysis of drinking task applied in individuals with upper extremity impairments after stroke. The drinking task incorporates reaching, grasping and lifting a cup from a table to take a drink, placing the cup back, and moving the hand back to the edge of the table. The sitting position is standardized to the individual&#39;s body size and the task is performed in a comfortable self-paced speed and compensatory movements are not constrained. The intention is to keep the task natural and close to a real-life situation to improve the ecological validity of the protocol. A 5-camera motion capture system is used to gather 3D coordinate positions from 9 retroreflective markers positioned on anatomical landmarks of the arm, trunk, and face. A simple single marker placement is used to ensure the feasibility of the protocol in clinical settings. Custom-made Matlab software provides automated and fast analyses of movement data. Temporal kinematics of movement time, velocity, peak velocity, time of peak velocity, and smoothness (number of movement units) along with spatial angular kinematics of shoulder and elbow joint as well as trunk movements are calculated. The drinking task is a valid assessment for individuals with moderate and mild upper extremity impairment. The construct, discriminative and concurrent validity along with responsiveness (sensitivity to change) of the kinematic variables obtained from the drinking task have been established.

This protocol describes an objective method to evaluate the movement performance and sensorimotor function of the upper extremity applied to individuals with stroke and healthy controls. A standardized test procedure, kinematic analysis and outcome variables for three-dimensional motion capture of drinking task are provided.

Análisis cinemático con movimiento 3D captura de tarea consumo en personas con y sin discapacidad de extremidad superior

Kinematic analysis is a powerful method for objective assessment of upper extremity movements in a three-dimensional (3D) space. Three-dimensional motion ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

Análisis de actividad de los nervios y conectividad mediante datos EEG intracraneal con Software SPM

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...