This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

Las prácticas utilizadas para obtener los tejidos de ratón fueron aprobados por el Cuerpo de Protección de los Animales (OPBA) de la Universidad de Trento (Italia), el protocolo no. 04-2015, Decreto Legislativo de acuerdo con el Artículo 31 no. 26/2014. Todos los ratones se mantuvieron en el Centro Organismo modelo del Centro de Biología Integrativa (CIBIO), Universidad de Trento, Italia. Precaución: Para evitar cualquier degradación del ARN de las muestras, preparar todos los tampones que usan agua tratada con DEPC para reducir al mínimo la contaminación de ARNasa. 1. Preparación de Polisomas de todo el cerebro <ol><li> La recopilación de los tejidos del cerebro (15 min) <ol><li> La eutanasia de tipo salvaje cepa de ratón C57BL / 6 con asfixia de CO 2 durante 5 min 36. Diseccionar cuidadosamente el cerebro fuera del cráneo 36, colocar el tejido en un tubo de 1,5 ml e inmediatamente colocarlo en nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Preparación de lisado (30 min) <ol><li> Pulverizar todo el tejido cerebral usandoun mortero bajo nitrógeno líquido. </li><li> Transferir aproximadamente 25 mg de polvo a un tubo de microcentrífuga de frío e inmediatamente (para evitar la descongelación del tejido pulverizado) añadir 0,8 ml de tampón de lisis (véase la Tabla 1) e interrumpir la célula pipeteando arriba y abajo 25 veces rápidamente. </li><li> Centrifugar el tubo a 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y mantener el tubo en hielo durante 15 min. </li><li> Centrifugar el tubo a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar los núcleos y mitocondrias. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Almacenar el sobrenadante a -80 ° C durante un máximo de 6 meses o utilizarlo inmediatamente. </li></ol></li><li> preparación gradiente de sacarosa y centrifugación (2 horas y 30 minutos) <ol><li> Lavado de tubos de ultracentrífuga extensamente con RNasa libre de agua (agua tratada diethylpyrocarbonate (DEPC-agua) o comercial) unad 3% de H 2 O 2 / DEPC disolución de H 2 O. </li><li> Poner los tubos en hielo y añadir 5,5 ml de solución de sacarosa al 50% frío en la parte inferior de cada tubo (ver Tabla 1 para soluciones de sacarosa). añadir con cuidado la gota solución de sacarosa al 15% a gota, manteniéndose cerca de la interfase con el fin de preservar una interfase nítida, hasta que el tubo esté completamente lleno. Cuando el tubo está completamente lleno, cerrarlo con un tapón de goma para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> En una habitación fría suavemente fijar los tubos en posición horizontal y mantenerlo en esta posición durante 2 horas. Después de este tiempo, lentamente enderece los tubos de nuevo en la posición vertical y ponerlos en hielo. Los gradientes son ahora listo para ser utilizado. Alternativamente, preparar el gradiente de sacarosa 15 a 50% usando un gradiente convencional anterior. </li><li> En un cuarto frío retirar con cuidado 1,0 ml de la parte superior de la pendiente y la superposición con la caída de sacarosa a gota con el lisado citosólica (es decir, el sobrenadante obtenido en step 1,2). </li><li> baje con cuidado los tubos en las cubetas del rotor de cubeta oscilante. Centrifugar los gradientes de 100 min a 180.000 xga 4 ° C utilizando una ultracentrífuga. </li><li> Después de la centrifugación, dejar los tubos en sus cubetas durante 20 minutos a 4 ° C para permitir que los gradientes se estabilicen. </li></ol></li><li> fraccionamiento en gradiente de sacarosa (2 hr) <ol><li> Retirar con cuidado un tubo de ultracentrífuga desde el rotor de ultracentrifugación y montarlo en el dispositivo colector de un gradiente de densidad sistema de fraccionamiento. Recoger fracciones de 1 ml de seguimiento de la absorbancia a 260 nm con un detector de UV / VIS (Ver Figura 1 panel superior). Mantenga las fracciones recogidas en el hielo. </li><li> Preparar alícuotas de 30-40 l de las fracciones de interés, mantenerlos en hielo antes de almacenarlas a -80 ° C hasta su uso. No utilice alícuotas o fracciones de sacarosa que se sometieron a más de dos ciclos de congelación-descongelación (véase la figura 1 panel inferior). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica (3 hr) <ol><li> El uso de la cinta, retire las láminas de mica. </li><li> Lavar las hojas de mica 3-4 veces con DEPC-agua y colocarlo en una pequeña placa de Petri. Después hay que secar la superficie con el aire. </li><li> Cubrir la mica con 200 l de 1 mM NiSO4 y se incuba durante 3 minutos a TA. </li><li> Retire la solución de níquel y luego secar la superficie con el aire. Llevar a cabo todas las medidas futuras a 4 ° C mediante la colocación de la placa de Petri con la mica en hielo. </li><li> Descongelar una alícuota obtenida en 1.4.2 en hielo y suavemente añadir toda la gota a gota de la muestra en la mica. Con una punta de 100 a 200 l, se extendió la muestra sobre toda la superficie de la mica. Incubar la muestra en hielo durante 3 min. </li><li> Cubrir la caída de la hoja de mica a gota con 200 l de tampón frío-AFM (véase la Tabla 1) y se incuba durante 1 hora en hielo. </li><li> Imaging en líquido <ol><li> Retirar con cuidado el Buffer-AFM y lavar las hojas de mica 3-4 vezs con 200 l de tampón frío-AFM para eliminar el exceso de sacarosa. A continuación, lavar las hojas de mica 3 veces con solución de lavado en frío (ver Tabla 1), dejando la superficie de mica cubierto por algunos microlitros de solución. </li><li> Ir hasta el punto 3 (Adquisición de imágenes). </li></ol></li><li> Formación de imágenes en el aire <ol><li> Retirar con cuidado el Buffer-AFM y lavar la mica 3-4 veces con 200 l de tampón frío-AFM para eliminar el exceso de sacarosa. A continuación, se lava la mica 3 veces con solución de lavado en frío (véase la Tabla 1) y drenar el exceso de agua con papel. </li><li> Deja secar la muestra bajo el capó química con la parte superior de la placa de Petri parcialmente abierta. Después de 2 horas, cierre la placa de Petri y se almacena a temperatura ambiente. Medir la muestra después de 2-3 horas, ya que son estables durante años. </li></ol></li></ol> 3. Adquisición de imágenes (15 min por la imagen después de la estabilización térmica) Nota: Polisomas inmovilizados sobre mica se pueden obtener imágenes en el aire o en forma líquida, se utiliza el modo de corriente alterna. <ol><li> Una la mica para el soporte de muestra usando cinta de doble cara. </li><li> Inserte el soporte de la muestra en la etapa de AFM siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuando la imagen en forma líquida, si es posible, trate de mantener la muestra a una temperatura inferior a 25 ° C para aumentar polisomas estabilidad en el tiempo. </li><li> Seleccionar un voladizo adecuada para obtener imágenes de CA y montarlo en el soporte de la punta siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso, el uso de voladizos con constante entre 2-20 N / m para obtener imágenes de aire y alrededor de 0,1 N / m para la imagen líquido vigor. </li><li> Ajuste el punto de láser en el voladizo cero y las señales de los detectores de cuadrante. </li><li> Seleccione una frecuencia de accionamiento oportuno y conducir el voladizo con una amplitud de 10 a 20 nm. </li><li> Acercarse a la muestra hasta que la punta se acopla a la superficie. </li><li> Seleccione un área de barrido de m 2x2, adquirir al menos 512x512 píxeles de las imágenes (ancho de píxel &lt;4 nm), seleccionar un modo de sustracción de fondo en vivo y una escala Z de 20-25 nm. </li><li> inspeccionar tque la imagen en busca de la presencia de objetos redondos que se caracterizan por la altura entre 10 y 15 nm al adquirir en el aire y 25 y 30 nm, cuando en líquido y la anchura en el intervalo de 25-30 nm. Ajustar los parámetros de consigna y la realimentación hasta que los objetos afilados se visualizan. El fondo debería aparecer relativamente plana en buenas muestras, con algunos objetos de altura 2-4 nm (véase la Figura 2A y B). </li><li> Si la imagen se ve bien (como se indica en el punto 3.8), adquirir varias exploraciones 2x2 micras (al menos diez) en las diferentes áreas de la muestra. </li><li> (opcional). Si es necesario, adquirir imágenes de alta resolución de polisomas seleccionados (véase la figura 2C). </li><li> Aplicar correcciones de software (la resta de avión y algoritmos de corrección de línea por línea) para corregir las imágenes de AFM eliminación de inclinación arbitraria y efectos a la deriva. </li></ol> 4. Análisis de Datos (30 minutos por imagen) <ol><li> Exportación de imágenes en ImageJ (opcional: aplicar un factor de escala) preferenteially utilizando un formato de compresión sin pérdidas, por ejemplo, el formato TIFF (véase la Figura 3A). </li><li> Utilice la macro RiboPick.ijm conjunto de herramientas ImageJ (a copiar en el subdirectorio macro / conjunto de herramientas ImageJ) para contar los ribosomas en polisomas (véase la Figura 3B) y calcular propiedades estadísticas de la muestra (véase la Figura 3C). <ol><li> Comenzará a cargar una imagen mediante la &lt;imagen Lee&gt; herramienta que inicia el programa. </li><li> Recoger los centros de ribosomas con la &lt;Selección de puntos&gt; estándar ImageJ herramienta (shift + clic izquierdo permite la selección múltiple de los ribosomas). Marcar los ribosomas seleccionados con el &lt;Marcar ribosomas&gt; herramienta. ribosoma coordenadas aparecerán en una ventana de texto personalizado. </li><li> Añadir más ribosomas a la misma polisomas repitiendo el procedimiento indicado en el punto 4.2.2. </li><li> Retire los ribosomas marcados erróneamente utilizando el &lt;Deshacer la última selección&gt; herramienta (comienza a eliminar de la última ribosoma añadido a la primera212; en el polisomas actual). </li><li> Cuando se haya completado la polisomas, utilice el &lt;polisomas Nueva&gt; herramienta. A medida que se añade el número de polisomas como una superposición a la imagen, se actualiza la ventana de texto. </li><li> Utilice el &lt;Guardar los resultados y cerca&gt; escribir el ribosoma coordina una imagen PNG que resume los ribosomas y polisomas el archivo elegido (se utilizan las unidades predeterminadas de la imagen) y. La imagen original se cerró sin ser salvado. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin.">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li><li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy.">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

Como la estructura del ADN fue demostrado ser de suma importancia para describir el proceso de la transcripción y la organización de la cromatina avanzada nuestra comprensión de control transcripcional de la expresión génica, es esencial para analizar la organización y estructura de polisomas para mejorar la comprensión veraz de la traducción y su regulación. Con el protocolo descrito, una densidad óptima de polisomas suavemente inmovilizados sobre una superficie plana, se obtiene ...

La síntesis de proteínas es el proceso que consume más energía en las células de 1,2. Por lo tanto, no es sorprendente que las abundancias de proteínas son controlados principalmente en la traslación en lugar de 3,4,5 nivel transcripcional. El polisomas es el componente macromolecular fundamental que convierte la información de ARNm en lecturas proteicos funcionales. Polisomas son hasta ahora reconocidos como complejos macromoleculares donde varios controles de traslación convergen 6-13. A pesar de cientos de estudios sobre la estructura del ribosoma 14- 16, los conocimientos moleculares detallados sobre la dinámica de la traducción y la topología de polisomas ha detectado un interés limitado. Como consecuencia de ello, la organización del complejo de ribonucleoproteína polisomico nativo y su efecto potencial sobre la traducción son todavía temas bien oscuros. Polisomas pueden ocultar las organizaciones ordenados y funcionales aún desconocidos, potencialmente reflejando lo nucleosomas y contro epigenéticals han representado para el campo de la transcripción. De hecho, la investigación de este intrigante hipótesis requiere de estudios adicionales y nuevos enfoques técnicos. En esta línea, las técnicas estructurales y microscopía de fuerza atómica pueden colaborar fructíferamente para desentrañar nuevos mecanismos para el control de la expresión génica, de manera similar a lo que se logró para el nucleosoma 17,18. Desde el descubrimiento del ribosoma 14-16, su estructura se ha caracterizado ampliamente en procariotas, levaduras 19,20 21 y más recientemente en humano 22, proporcionando la descripción molecular de los mecanismos en la base de la síntesis de proteínas. Polisomas se registran inicialmente en la membrana del retículo endoplasmático, formando organizaciones geométricas 2D típicos 14. Como se ha mencionado antes, polisomas asamblea no ha sido objeto de interés constante a medida que la estructura del ribosoma. En el pasado, se han estudiado polisomas esencialmente por trtécnicas ansmission EM-basa. Sólo recientemente, las técnicas de crio-EM permitieron la reconstrucción 3D de polisomas purificados a partir de sistemas de traducción in vitro 23-26, lisados ​​celulares humanos en 27 o 28 células. Estas técnicas ofrecen información más precisa acerca de la organización de ribosomas ribosoma en polisomas 23, 26-28 y una descripción molecular preliminar de las superficies de contacto de los ribosomas adyacentes en polisomas germen de trigo 24. Por lo tanto, la tomografía crio-EM permite la divulgación de las interacciones de ribosomas ribosoma con detalle molecular, pero está cargado por una extensa post-procesamiento y análisis de reconstrucción que requiere recursos computacionales pesadas para el manejo de datos. Por otra parte, para obtener el detalle molecular de las interacciones de ribosomas ribosoma, se requiere un mapa de carreteras de resuelto de los ribosomas, y este tipo de ribosoma de referencia está disponible sólo para unas pocas especies. Es importante destacar que, tomografía crio-EM no es capaz de detectar RNA libre. Therefel mineral, se requieren nuevas técnicas para entender completamente la organización de la maquinaria de traducción. Al lado de la crio-EM, AFM ha sido también empleado como una herramienta útil para obtener imágenes directas de polisomas en eucariotas inferiores 29-33 y los seres humanos 27. En comparación con EM, AFM no requiere la fijación de la muestra o el etiquetado. Además, las mediciones se pueden llevar a cabo en condiciones fisiológicas cerca de y con la posibilidad única de identificar claramente los dos ribosomas y cadenas de ARN desnudos 27. Obtención de imágenes de polisomas individuales se puede realizar de forma relativamente rápida, obteniendo miles de imágenes en nano-resolución con poco esfuerzo post-procesamiento en comparación con la extensa y pesada de post-procesamiento y análisis de la reconstrucción requerida por microscopía de crio-EM. En consecuencia, AFM manejo y análisis de datos no necesita caras estaciones de trabajo y potencia de computación de alto. Como tal, esta técnica recoge información sobre formas polysomal, características morfológicas (por ejemplo,altura, longitud y anchura), las densidades de ribosomas, la presencia de ARN libre y el número de ribosomas por polisomas 27 con un rendimiento más alto que la crio-EM. De tal manera, AFM representa un enfoque poderoso y complementario a las técnicas de EM para retratar polisomas 27. Aquí presentamos una tubería completa de purificación para el análisis de datos en la que se aplica a la imagen de AFM y analizar polisomas cerebro de ratón. El protocolo propuesto se centra en cuestiones de purificación y en la deposición precisa de polisomas sobre sustratos de mica que se utilizan para obtener imágenes de AFM. Además del análisis de partícula convencional que puede ser fácilmente realizó con el software común usado por la comunidad AFM, un plugin de ImageJ 34, llamado RiboPick, se presenta para contar el número de ribosomas por polisomas 27, 35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89836</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock RNAse Inhibitor</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>EO-0381</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40718</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Sucrose gradient preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima LE-80K</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW 41 Ti</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Fractionation System&#160;</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td>67-9000-176</td>
			<td>Sucrose gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>Cypher</td>
			<td>Polysome visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

La maquinaria de traducción, es decir, el polisomas o polyribosome, es uno de los mecanismos citoplásmicos más grandes y más complejos en las células. Polisomas, formadas por los ribosomas, ARNm, varias proteínas y ARN no codificantes, representan plataformas donde los controles se llevan a cabo de traslación integrado. Sin embargo, mientras que el ribosoma se ha estudiado ampliamente, la organización de polisomas todavía falta comprensión global. Por lo tanto se requiere un gran esfuerzo con el fin de dilucidar organización polisomas y cualquier nuevo mecanismo de control de la traducción que puede ser embebido. Microscopía de fuerza atómica (AFM) es un tipo de microscopía de barrido de la sonda que permite la adquisición de imágenes en 3D con una resolución de escala nanométrica. En comparación con técnicas de microscopía electrónica (EM), una de las principales ventajas de AFM es que se puede adquirir miles de imágenes tanto en el aire y en solución, lo que permite que la muestra se mantendrá en condiciones fisiológicas cerca sin necesidad de tinción y la fijación de proprocedimientos. Aquí, se describe un protocolo detallado para la purificación exacta de polisomas de cerebro de ratón y su deposición sobre sustratos de mica. Este protocolo permite obtener imágenes polisomas en el aire y líquido con AFM y su reconstrucción como objetos tridimensionales. Complementario al crio-microscopía electrónica (crio-ME), el método propuesto puede ser utilizado convenientemente para el análisis sistemático de polisomas y el estudio de su organización.

Sacarosa perfiles polisomico gradiente de todo el cerebro de ratón Es posible purificar polisomas partir de un lisado celular por un perfil de polysomal, que separa macromoléculas de acuerdo a su peso y tamaño. Con perfiles polysomal, lisados ​​citoplásmicos obtenidos a partir de células o tejidos cultivados, como en este ejemplo, se cargan en un gradiente de sacarosa lineal y procesados ​​por ult...

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K vistas.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

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State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

La dependencia estatal Efectos sobre la EMT: Una mirada a la conducta motriz fosfeno

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Investigación

Neurociencias

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

La caracterización de propiedades mecánicas Multiescala de tejido cerebral mediante microscopía de fuerza atómica, Impacto sangría, y Rheometría

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Análisis de la marcha automática en ratones con lesión de la constricción crónica

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Asomándose al cerebro Polisomas con microscopía de fuerza atómica

Resumen

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