Para comenzar, siembre las células de osteosarcoma humano 143B en una placa de seis pocillos. Una vez que las células se vuelven 75% confluentes, reemplace el medio en cada pocillo con el medio que contiene 10 milimolares de aspartato 13C4 e incube durante ocho horas para lograr un estado estable para etiquetar las células. Para aislar metabolitos, enfríe el tampón preparado durante la noche a menos 80 grados centígrados o colóquelo en hielo seco.
Mientras tanto, tome un plato de la incubadora y aspire el medio de cada pocillo con una pipeta. Lávelo con PBS dos veces y luego retire el PBS residual antes de continuar. Ahora coloque la placa en hielo seco y agregue 800 microlitros de tampón preparado a cada pozo.
Para facilitar la lisis celular, incubar la placa durante 15 minutos a menos 80 grados centígrados. Después de la incubación, raspe cada pocillo en hielo seco con un elevador celular y transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 15 mililitros colocado en hielo seco. Vortex el lisado durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y centrifugarlo a cuatro grados centígrados y 17.000 g durante 10 minutos.
Luego transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros y séquelo en un concentrador de vacío de cuatro grados Celsius con una trampa fría bajo un alto vacío durante aproximadamente seis horas. Almacene el pellet de metabolito seco a menos 80 grados centígrados hasta que se vuelva a usar. Para analizar la muestra utilizando cromatografía líquida espectrometría de masas o LCMS, agregue 100 microlitros de agua de grado HPLC al pellet seco y al vórtice como se demuestra.
Centrifugar las muestras a cuatro grados centígrados durante 10 minutos a velocidad máxima. Luego transfiera 25 microlitros de sobrenadante al vial LCMS e inyecte dos microlitros en el sistema LCMS. Para realizar cromatografía líquida, utilice un caudal constante de 0,15 mililitros por minuto, bajo el modo de gradiente de una fase B móvil de 80 a 20% durante 20 minutos, 20 a 80% durante 0,5 minutos, y mantenga al 80% durante 7,5 minutos contra la fase móvil A.A continuación, realice la espectroscopia de masas eligiendo un escaneo completo entre mz 70 a 1, 000 Dalton.
Y resolución a 70.000. Establezca el objetivo AGC de una vez 10 a la sexta, y un tiempo máximo de inyección de 20 milisegundos. A continuación, establezca el tiempo de ejecución en 16,5 minutos.
Polaridad establecida en positiva. Objetivo de AGC establecido en uno a la potencia de cinco. Máximo de TI establecido en 20 milisegundos.
Y el rango de escaneo se establece en una relación masa-carga de 70 a 1.000. Luego ajuste el voltaje de pulverización a 3.0 kilovoltios. Y el capilar calentado a 275 grados centígrados.
Seleccione el flujo de gas de vaina a 40 unidades, el flujo de gas auxiliar a 15 unidades y el flujo de gas de barrido a una unidad. Para el trazado de isótopos de glutamina 13C5, una vez que las células alcanzan el 75% de confluencia, cambie el medio a dos milimolares que contienen glutamina 13C5 e incube para lograr un estado estable de etiquetado de las células de interés. Aislar y analizar los metabolitos como se demostró anteriormente.
Después de aislar y analizar los metabolitos, analice la actividad de la succinato deshidrogenasa o SDH calculando el porcentaje de etiquetado de fumarato 13C3, fumarato 13C4, succinato 13C3 y succinato 13C4. Luego evalúe la oxidación del succinato y la reducción del fumarato utilizando la fórmula. En condiciones tratadas con vehículos, el complejo SDH favoreció la actividad hacia adelante, y la incorporación de succinato 13C4 en fumarato 13C4 fue mayor que fumarato 13C3 en succinato 13C3.
En las células de osteosarcoma tratadas con antimicina, el complejo SDH favoreció la actividad inversa, y la incorporación de fumarato 13C3 en succinato 13C3 fue más significativa que el succinato 13C4 en fumarato 13C4.
