Antes de la tinción inmunofluorescente múltiple, fijar el tejido y realizar la desparafinización y la inhibición endógena de la peroxidasa. Luego, para la tinción inmunofluorescente múltiple, sumergió los portaobjetos en un frasco de tinción de 300 mililitros que contenía tampón de citrato milimolar de 10 milimolares complementado con Triton X-100 al 0,1%. Coloque el frasco de tinción con la tapa cerrada en un microondas durante tres a cinco minutos a máxima potencia hasta que el tampón comience a hervir.
Después de hervir, deje el tampón a una temperatura cercana a la ebullición poniendo el microondas a baja potencia durante 15 minutos. Nuevamente, caliente el búfer poniendo el microondas a máxima potencia durante 90 segundos. Retire el frasco del microondas y deje que el tampón se enfríe durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Enjuague las diapositivas tres veces durante cinco minutos cada una en agua destilada, seguido de cinco minutos de enjuague en solución salina tamponada con Tris que contiene 0.1% Tween 20 o TBS Tween. Después del último lavado, retire la interpolación TBS secando las diapositivas en una toalla de papel. A continuación, coloque los portaobjetos en una caja de portaobjetos de microscopio y rodee el tejido con un bolígrafo hidrófobo.
Bloquee los sitios de unión no específicos cubriendo el tejido con 5% de BSA disuelto en TBS Tween. Después de 30 minutos, retire el búfer de bloqueo secando las diapositivas en una toalla de papel. A continuación, incubar el tejido durante 60 minutos con 300 microlitros de anticuerpo primario diluido en 1% BSA, TBS Tween.
Después de la incubación, enjuague los portaobjetos tres veces durante tres minutos cada uno con TBS Tween. Después del lavado, incubar el tejido durante 40 minutos con 300 microlitros de anticuerpo secundario Poly-HRP. Después de la incubación, enjuague los portaobjetos tres veces durante tres minutos cada uno con TBS Tween.
A continuación, incubar el tejido durante 10 minutos con 300 microlitros de reactivo de tiramida de fluorocromo diluido 200 veces en tampón de borato suplementado extemporáneamente con peróxido de hidrógeno al 0,003%. Luego enjuague los portaobjetos tres veces con TBS Tween e incube el tejido durante la noche a cuatro grados centígrados con el anticuerpo humano pan-citoqueratina diluido en 1% BSA, TBS Tween. Al día siguiente, enjuague el tejido con TBS Tween e incube durante 120 minutos con el anticuerpo secundario directamente acoplado con fluorocromo diluido 200 veces en 1% BSA, TBS Tween.
Después de la incubación, enjuague el tejido con TBS Tween antes de teñir los núcleos con bisBenzimide diluida 1, 000 veces en 10% BSA, TBS Tween durante cinco minutos. Enjuague el pañuelo tres veces durante tres minutos cada una en agua destilada antes de montarlo en un portaobjetos utilizando un medio de montaje de fluorescencia y vidrio de cubierta de borosilicato. Para el análisis de imágenes, importe los escaneos a un software de análisis de imágenes.
A continuación, vaya a la pestaña Análisis y seleccione el algoritmo de fluorescencia de alta plexación haciendo clic en Configuración, Acciones y, a continuación, en Cargar. Seleccione la pestaña Selección de tinte y el tinte que le interese. En la pestaña Detección nuclear, vaya a Tipo de segmentación nuclear y seleccione AI Custom.
A continuación, en el clasificador de segmentación nuclear, seleccione el AI.In entrenado guardado en la pestaña Detección de membrana y citoplasma, elija el radio máximo de citoplasma y el número de colorantes de membrana. Para cada colorante, seleccione el umbral positivo para el núcleo, el umbral positivo para el citoplasma y el umbral positivo para la membrana. Para cada colorante, seleccione el núcleo, la membrana y el porcentaje de citoplasma de los valores de completitud.
Guarde el algoritmo seleccionando Configuración, Acciones y Guardar. Analice la región de intereses haciendo clic en Analizar y seleccionando Capa de anotación. A continuación, vaya a la pestaña Resultados y seleccione todos los datos en Datos de objeto.
Exporte los datos en formato CSV haciendo clic con el botón derecho en Exportar y seleccionando objectdata.csv. Se muestra un resultado representativo de la tinción óptima por inmunofluorescencia múltiple. La elección de la dilución correcta fue esencial para verificar la especificidad del anticuerpo y optimizar la relación señal-ruido de la tinción.
