Prepare la solución de ORO disolviendo 0,5 gramos de polvo de ORO en 100 mililitros de isopropanol para generar una solución madre. Prepare la solución de trabajo para todos los músculos combinando la solución madre de ORO y agua desionizada en una proporción de 60 a 40. Cubra la solución de trabajo durante 10 minutos para permitir que las partículas se asienten.
Filtrarlo a través de una malla de 40 micrómetros, seguido de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. A continuación, retire la solución de formaldehído de los músculos descelularizados en la placa de pocillos y lave los músculos tres veces con un volumen igual de PBS. Luego, reemplace el PBS con un volumen igual de solución de isopropanol al 60% e incube en el agitador oscilante durante cinco minutos.
Una vez hecho esto, reemplace la solución de isopropanol al 60% con una solución de trabajo ORO antes de los 10 minutos de incubación en el agitador oscilante. A continuación, reemplace la solución de trabajo ORO con un volumen igual de 1 % SDS e inspeccione la solución SDS periódicamente. Una vez que la solución se vuelva notablemente rosada, reemplace la solución SDS con una nueva SDS al 1 %.
Cuando la solución permanezca clara durante 24 horas, reemplace la SDS del 1 % por PBS. Bajo un microscopio estereoscópico de cuatro aumentos, elimine cualquier residuo o partícula obvia adherida al exterior del músculo manchado. Si la tinción es satisfactoria, mostrando las esferas de color rojo brillante flotando en una matriz transparente, adquiera las imágenes de tinción utilizando una cámara conectada al microscopio estereoscópico.
Los músculos correctamente descelularizados eran blancos y semitransparentes. Cuando los músculos descelularizados se tiñeron con ORO para visualizar el tejido adiposo intramuscular, o IMAT, las gotas de lípidos IMAT eran evidentes dentro de las estructuras musculares claras como esferas rojas. Los músculos sanos de las extremidades traseras de ratón mostraron un poco de IMAT natural evidenciado por poco o ningún lípido rojo o positivo en comparación con los músculos de las extremidades traseras inyectados con toxina cardiovascular o glicerol.
La descelularización incompleta se identificó inmediatamente después del tratamiento inicial con SDS o después del lavado de la tinción de ORO como fibras semiopacas de color rosa claro. La eliminación incompleta de ORO se identificó después del lavado de ORO como un fondo uniforme rosado o rojo en lugar de líneas de fibra distintivas.
