Para comenzar la cuantificación de las métricas de gotas de lípidos IMAT teñidas, abra Pilas confocales en ImageJ. Abra la interfaz de usuario de Threshold seleccionando Imagen, luego Ajustar y luego Umbral. En la interfaz de usuario, seleccione Intermodos como tipo de umbral y asegúrese de que la opción Fondo oscuro esté seleccionada.
A continuación, haga clic en Aplicar para ejecutar un algoritmo de umbrales. Ejecute el algoritmo de cuenca hidrográfica para separar las gotas lipídicas que se tocan seleccionando Proceso, luego Binario y Cuenca hidrográfica. Seleccione Sí en un cuadro de diálogo para procesar todas las imágenes de la pila y agregar una línea negra delgada que divida áreas más grandes de blanco sólido.
Para establecer los tamaños de partícula máximo y mínimo, abra la imagen original y delinee la gota de lípidos más pequeña y más grande a la vista con la herramienta Óvalo. A continuación, agregue estas formas al Administrador de ROI escribiendo T.Seleccione Analizar y, a continuación, Establecer medidas. En el cuadro de diálogo, seleccione la configuración, marque Solo área y haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Medir en el Administrador de ROI.
Utilice las dos medidas de área de esta ventana de resultados como rango de tamaño y analice las partículas. Identificar la región de interés, o ROI, con el algoritmo de análisis de partículas. Seleccione Analizar y, a continuación, Analizar partículas.
Se abre un cuadro de diálogo para establecer la configuración de selección. Para generar las mediciones de ROI, seleccione Analizar, luego Establecer medidas y seleccione Área, Centroide, Ajustar elipse y Posición de pila. Haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Medir en el Administrador de ROI.
Los datos de la tabla de resultados se pueden seleccionar y copiar en Excel para su posterior análisis. Para una evaluación detallada de las métricas y la distribución de las gotas de lípidos individuales, se obtuvieron imágenes de las gotas de lípidos marcadas con fluorescencia BODIPY mediante microscopía confocal. El umbral y la segmentación de la forma proporcionaron un buen primer paso para generar ROI para cada gota de lípido.
Sin embargo, se necesitaron ediciones manuales para corregir los errores. Las gotas de lípidos profundos, que aparecían tenues en la imagen, se pueden agregar a mano con la herramienta Óvalo en ImageJ. Un grupo de gotas de lípidos identificadas erróneamente como un solo ROI también se puede corregir eliminando y reemplazando el ROI original con múltiples ROI nuevos.
Cuando una sola gota de lípidos se identificó como un ROI único en múltiples cortes, los ROI duplicados se consolidaron en un solo ROI.
