Para comenzar, tome la muestra de tejido clínico comprimido o fresco digerido y expandido y proceda con la tinción de anticuerpos colocándola en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos. Lave la muestra tres veces con PBS durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente. Dependiendo del tamaño de la muestra, agregue de 0,5 a 2 mililitros de los anticuerpos primarios en el tampón de tinción para cubrir el gel adecuadamente.
Incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Luego, lave la muestra tres veces con PBS durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente. Añadir los anticuerpos secundarios correspondientes e incubar durante tres horas a 37 grados centígrados en el tampón de tinción de elección.
Vuelva a lavar la muestra como se demostró anteriormente y agregue de 1 a 2 mililitros de polietilenglicol a la muestra en una placa de seis pocillos. Tiñir la muestra con éster NHS conjugado con flúor 4 durante tres horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lavar la muestra tres veces con PBS.
A continuación, para realizar la tinción lipídica, tome la muestra de tejido expandido lavada tres veces en PBS, aplique un colorante lipofílico convencional diluido 200 veces en 2 mililitros de Triton X-100 o PBS al 0,1% durante 72 a 96 horas a temperatura ambiente y lave al menos tres veces con PBS. Para realizar FISH, prepare el tampón de hibridación combinando 2 x SSC, 10 % de sulfato de dextrano, 20 % de carbonato de etileno y 0,1 % de Tween 20. Colocar muestras de gel homogeneizadas en un tampón de hibridación precalentado a 60 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, incubar las muestras de gel con un tampón de hibridación que contenga 10 sondas FISH picomolares contra el gen diana durante la noche a 45 grados centígrados. Lave las muestras con tampón de lavado riguroso dos veces durante 15 minutos cada una a 45 grados centígrados y dos veces durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Lave la muestra tres veces con PBS durante 10 minutos y proceda con la obtención de imágenes o el almacenamiento de la muestra en PBS más azida de sodio al 0,02 % a 4 grados centígrados.
Para expandir completamente y obtener imágenes del tejido, mueva las muestras expandidas cuatro veces en PBS a una placa de imágenes de seis pocillos con fondo de vidrio. Si la muestra se ha expandido más, córtela en trozos más pequeños. Aplique polilisina al 0,1% a la superficie del vidrio.
Coloque la muestra en el portaobjetos y elimine el exceso de líquido alrededor del gel con un paño de laboratorio de papel para evitar el movimiento del gel durante la toma de imágenes. Después, realice imágenes de fluorescencia con un microscopio convencional de campo amplio, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección. Después de la obtención de imágenes, reduzca las muestras en PBS con al menos tres lavados de 10 minutos, ya que el almacenamiento a largo plazo en agua desionizada conduce a la degradación de la señal fluorescente.
Finalmente, almacenar las muestras en PBS con azida de sodio al 0,02% a 4 grados centígrados. Las imágenes confocales del tejido cerebral de ratón completamente expandido permitieron la visualización de proteínas y estructuras celulares y de membrana mitocondrial. También se identificaron los ácidos nucleicos del tejido de ganglios linfáticos humanos formales y fijados incluidos en parafina.
Después de una expansión de 3,5 veces de la sección del riñón, se observó el glomérulo expandido sin grietas. Sin embargo, el anclaje u homogeneización inadecuados dieron lugar a grietas, distorsiones y la pérdida de objetivos marcados en otra sección del riñón.
