Comience preparando soluciones madre de todos los anticuerpos a 2.000 microgramos por mililitro. Luego, para cada anticuerpo, etiquete los tubos de dilución con sus respectivas concentraciones, incluido el nombre del anticuerpo. También se incluye un tubo en blanco para cada anticuerpo como control del vehículo PBS-TBN.
A continuación, agregue 75 microlitros de PBS-TBN a todos los tubos de dilución de anticuerpos etiquetados como 500 microgramos por mililitro o menos, incluidos los tubos de control solo para vehículos. Para cada anticuerpo, pipetear 150 microlitros de la solución madre en el tubo etiquetado como 1.000 microgramos por mililitro. Para crear una serie completa de diluciones para cada anticuerpo, transfiera 75 microlitros del tubo de 1.000 microgramos por mililitro a la siguiente dilución inferior de la serie.
Después, cierra el tubo de dilución recién completado y vórdalo brevemente. A continuación, se añadieron 25 microlitros de anticuerpos diluidos en los pocillos designados de una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se añadieron 25 microlitros de PDL1 humano recombinante biotinilado a cada pocillo de reacción. Cubra la placa de microtitulación con una lámina o un sello adhesivo de plástico e incube a temperatura ambiente durante una hora agitando en un agitador de placas orbital a 600 RPM.
A continuación, diluya las perlas acopladas a PD1 humano recombinante a una concentración de 50.000 perlas por mililitro con PBS-TBN. Retire la placa de reacción de microtitulación de 96 pocillos del agitador y retire el sello de la placa adhesiva. Agregue 50 microlitros de la mezcla de perlas acopladas PD1 humana recombinante a cada pocillo.
Selle la placa herméticamente e incube durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente en un agitador orbital ajustado a 600 RPM. Después de la incubación, retire con cuidado el sello de la placa adhesiva. Luego coloque la placa en el separador de placas magnéticas durante dos minutos para inmovilizar las perlas.
Confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien conectados. Dale la vuelta al plato y desecha el sobrenadante con cuidado. Para lavar el exceso de reactivos de reacción de las perlas, retire la placa de microtitulación del separador de placas magnéticas y agregue 150 microlitros de PBS-TBN a cada pocillo.
Después de retirar el sellador e inmovilizar las perlas como se demuestra, confirme que el imán y la placa de microtitulación estén asegurados y descargue el sobrenadante. Ahora agregue 100 microlitros de solución de trabajo SAPE a cada pocillo de reacción y vuelva a suspender las perlas mediante pipeteo. Selle la placa e incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
A continuación, retire con cuidado el sellador de placas adhesivas una vez que las cuentas estén inmovilizadas y el imán y la placa estén asegurados. Vierta suavemente el sobrenadante invirtiendo la placa. Para lavar el exceso de SAPE de las perlas, retire la placa de microtitulación del soporte de la placa magnética y agregue 150 microlitros de PBS-TBN a cada pocillo para resuspender las perlas.
A continuación, inmovilice las perlas colocando la placa de microtitulación en un separador de placas magnéticas durante dos minutos. Después de confirmar que el imán y la placa de microtitulación están asegurados, invierta la placa y retire el sobrenadante. A continuación, agregue 100 microlitros de inmunoglobulina G conjugada anti-humana o anti-conejo Brilliant Violet 421 diluida a sus respectivos pocillos.
Selle la placa e incube durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, inmovilice las cuentas y retire el sellador de placas adhesivas. Confirme que el imán y la placa de microtitulación estén asegurados y deseche el sobrenadante.
Lave el exceso de anticuerpos secundarios de las perlas agregando 150 microlitros de PBS-TBN a cada pocillo para resuspender las perlas. A continuación, coloque la placa de microtitulación en el separador de placas magnéticas durante dos minutos para inmovilizar las perlas. Confirme que el imán y la placa de microtitulación estén bien unidos y, a continuación, invierta la placa y vierta el sobrenadante.
Una vez retirado el cuarto y último tampón de lavado, saque la placa de microtitulación del separador de placas magnéticas. Con una pipeta, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de PBS-TBN por pocillo. Finalmente, para determinar la intensidad fluorescente mediana de cada reacción, lea la placa en el sistema de análisis de flujo de reportero dual con el volumen de aspiración establecido en 50 microlitros, el recuento mínimo de perlas en 100 perlas, el ajuste de tiempo de espera en 40 segundos, el rango de compuerta en 7,000 a 17,000 y el modo de funcionamiento en el reportero dual.
Los cuatro anticuerpos policlonales anti-PDL1 bloquearon la interacción recombinante de PDL1 humana con PD1. El porcentaje de inhibición de los diferentes anticuerpos anti-péptidos PDL1 osciló entre el 48% y el 74% a la concentración máxima probada de 1.000 microgramos por mililitro. El anticuerpo monoclonal de control positivo atezolizumab logró un bloqueo del 92% de la interacción PD1-PDL1 a la concentración máxima probada de cuatro microgramos por mililitro.
El análisis comparativo de unión de anticuerpos candidatos inducidos por PDL1 vacuna a PDL1 humana recombinante indicó que los cuatro anticuerpos policlonales anti-PDL1 péptidos unidos a PDL1 humano recombinante de una manera dependiente de la concentración. El anticuerpo anti-PDL1(130) mostró la señal de unión a RH PDL1 más alta de los cuatro candidatos a anticuerpos inducidos por la vacuna PDL1.
