Comience preparando un sándwich de gel de página polimerizado. Retire las abrazaderas y las capas de cinta de papel y retire lentamente el peine. Enjuague bien los pozos con agua destilada.
Coloque el sándwich de gel correctamente en el aparato de electroforesis vertical. Llene los depósitos superior e inferior con tampón TBE. Caliente las placas realizando una electroforesis previa en gel durante al menos 30 minutos a 50 vatios.
Mientras tanto, vuelva a suspender las muestras secas en cinco microlitros de tampón de carga de gel desnaturalizante. A continuación, use una jeringa pequeña llena de tampón TBE para eliminar la urea de los pocillos del gel. Ahora cargue las muestras en los pozos limpios, tomando nota del olor de la carga.
Ejecute el gel durante dos horas a 50 vatios o hasta que el tinte azul de bromofenol haya agotado 2/3 del gel. Después de la electroforesis, apague la fuente de alimentación, retire con cuidado el sándwich de vidrio y limpie las placas de vidrio. Coloque el gel en un generador de imágenes de gel para detectar la fluorescencia de las bandas de oligonucleótidos marcadas con FAM.
Después de una, cuatro y 15 horas de incubación, Bsep 1 de cinco o 50 micromolares reaccionó con dos muestras micromolares de TBA G4, TBA monocatenario y TBA bicatenario. Se cargaron controles para cada conjunto de muestras. El sustrato G4 TBA mostró solo un aducto de alquilación debido a la disponibilidad de solo G8 para la alquilación y la posterior escisión trenzada.
Se observaron múltiples aductos y bandas de productos de escisión en TBA monocatenario y bicatenario, debido a que todas las guaninas fueron susceptibles a la reacción de BSEP. La reacción de sondeo y el tampón tris dieron como resultado un mapeo químico ineficiente debido a la presencia de nucleófilos no deseados, lo que provocó una reducción de la propioactividad. Las muestras de G4 TBA mostraron solo la formación de aductos sin escisión trenzada.
Para el TBA monocatenario y bicatenario, solo una incubación de 24 horas condujo a la fragmentación del ADN, comparable a la fragmentación de 15 horas sin Tris.
