Para comenzar, tome una placa de cultivo de 24 pozos previamente sentada y coloque un deslizamiento de cubierta de vidrio en cada pozo. Luego agregue 800 microlitros de medio de cultivo que contenga 10% FBS y DMEM. Después de ajustar la concentración celular.
Incubarlo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Luego deseche el medio de cultivo y lave las células con PBS. Suspender las células en 800 microlitros de medio de inducción DMEM que contiene BSA.
Disuelva el ácido linoleico en etanol anhidro para preparar una solución estándar a una concentración de 100 milimolares por litro. Agregue ácido linoleico en gradiente creciente a la placa y repítalo cuatro veces. Luego incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Al final de la incubación, retire el medio de cultivo y lave las células con PBS tres veces. Fíjalos con 400 microlitros de aldehído paraformado al 4% durante 20 minutos. Luego deseche la solución fijadora y lávelos nuevamente.
Incubar las células con alcohol isopropílico al 60% durante cinco minutos y luego desecharlo. Agregue la solución de trabajo rojo O de aceite recién preparada y deséchela después de 20 a 30 minutos. Lave las células con PBS de dos a cinco veces hasta que se elimine el exceso de solución de colorante.
Vuelva a teñir el núcleo con 300 microlitros de solución de hematoxilina durante uno o dos minutos. Luego deseche la solución de tinte y lávelos nuevamente. Retire el resbalón de la cubierta de vidrio de la placa lavada PBS y colóquelo con las celdas hacia abajo sobre un portaobjetos microscópico que contenga 10 microlitros de sellador de tabletas.
Para medir el tamaño y el número de LD, encienda el interruptor de la computadora y el microscopio sucesivamente y coloque el portaobjetos en la plataforma de carga. Luego abra el software de análisis de imágenes. Encuentre las imágenes a baja potencia y gotee una cantidad adecuada de aceite de cedro en la diapositiva de imágenes.
Ajuste gradualmente el objetivo 200x y ajuste el campo de visión hasta encontrar una imagen clara. Luego capture imágenes de las regiones deseadas y guárdelas. Al azar, seleccione 60 LD para cada imagen y mida el diámetro.
Exporte los resultados de la medición a una tabla para analizar el tamaño promedio y la relación de distribución de LD. Las células cultivadas de hepatocitos teñidas mostraron diferentes tamaños y números de LDs. Bajo las diferentes concentraciones de tratamiento con ácido linoleico.
El número de LD por célula se correlacionó negativamente con diferentes concentraciones de ácido linoleico. La mediana del número de LD por célula fue de 136 para el grupo tratado con ácido linoleico de 100 micromolares por litro y disminuyó a altas concentraciones. El diámetro promedio de LD en el grupo control fue de 0,72 micrómetros, que aumentó con el aumento de la concentración en el grupo tratado con ácido linoleico.
Una alta concentración de ácido linoleico aumentó la proporción de LD grandes y disminuyó los LD pequeños.
