Para comenzar, tome la mezcla maestra digital de gotas descongeladas o ddPCR y agréguele sondas, imprimación directa y cebador inverso a temperatura ambiente. Prepare la mezcla maestra para cada objetivo de amplificación siguiendo la composición sugerida que se muestra en la pantalla, y ajuste las concentraciones de cebadores y sondas según sea necesario. Vortex la mezcla a fondo y centrifugarla brevemente en una mini centrífuga.
Añadir la enzima de restricción e invertir para mezclar. A continuación, agregue 16.5 microlitros de la mezcla maestra preparada a cada pocillo de una placa de PCR y selle la placa con una película adhesiva transparente. Utilizando el tampón de dilución de la muestra como diluyente, prepare el control de calidad o diluciones de control de calidad como se describe en esta tabla que representa las concentraciones recomendadas para una ejecución de precisión y exactitud de validación.
Diluya las muestras de lágrimas con un tampón de dilución de muestras en una proporción de 1 a 10 en tubos de PCR de 0,2 mililitros y selle los tubos. Caliente las muestras en un termociclador a 95 grados centígrados durante 10 minutos y luego a 4 grados centígrados durante al menos 5 minutos. Retire la película adhesiva de la placa ddPCR que contiene la mezcla maestra y agregue 5,5 microlitros de dilución de control de calidad a los pocillos apropiados de la placa de 96 pocillos como se muestra en el mapa de placas.
Luego agregue 5.5 microlitros de muestra a los pocillos. Agregue 5.5 microlitros de tampón de dilución de muestra a los pocillos sin control de plantilla o NTC. Diluya el control tampón 2x ddPCR en una proporción de 1 a 2 utilizando agua libre de nucleasa y agregue 22 microlitros del tampón a cualquier pozo vacío de una columna.
Agregue un sello de lámina perforable a la placa y coloque la placa en el sellador de placas. Selle la placa durante 5 segundos a 180 grados centígrados. Vortex la placa a la velocidad máxima durante al menos 30 segundos y centrifugar brevemente en un spinner de placas.
En la pantalla táctil del generador automatizado de gotas, seleccione las columnas en el mapa de placas que contiene las muestras. La plataforma del instrumento se iluminará para indicar qué consumibles se requieren. Cargue el generador de gotas de atrás hacia adelante.
La luz amarilla cambiará de amarillo a verde para indicar la suficiencia de los consumibles. Coloque un bloque frío y el soporte de la placa de gotas. Asegúrese de que el bloque sea completamente de color azul y que no se vea ningún color rosa.
Coloque una nueva placa ddPCR de soldadura 96 en el bloque frío. Coloque la placa de PCR preparada en el soporte de la placa de muestra. Cierre la tapa de la máquina y pulse start para la generación de gotas.
Dentro de los 30 minutos, retire la placa que contiene las gotas del bloque frío. Agregue un sello de lámina perforable a la placa y coloque la placa en el sellador de placas. Séllelo durante cinco segundos a 180 grados centígrados.
A continuación, coloque la placa en un termociclador compatible e introduzca las condiciones de ciclo que se muestran en la pantalla. Cargue la placa en el lector de gotas asegurándose de que quede suficiente aceite del lector y que el contenedor de residuos tenga suficiente espacio. Finalmente, presione el botón de lectura en el software para comenzar a leer las gotas.
Se calculó una media intra ensayo para cada concentración en cada ensayo y se utilizó para evaluar la precisión y exactitud del ensayo. Se encontró una precisión media entre ensayos del 7,7% y una precisión media absoluta entre ensayos del 4,2% en todos los niveles de control de calidad. La exactitud y la precisión entre ensayos también se calcularon utilizando la media entre ensayos de cada nivel de control de calidad dentro de cada lote.
Se encontró una precisión entre ensayos que varió de 4 a 8,5% y una precisión absoluta entre ensayos que varió de uno a 3,2%. Del mismo modo, para la muestra lagrimal se observó una precisión media entre ensayos del 3,7% en el nivel de pico alto y del 12,2% en el nivel de pico bajo y una precisión absoluta media entre ensayos del 11,3% en el nivel alto y del 8,1% en el nivel bajo. En el caso del cálculo entre ensayos, se encontró una precisión del 5,5% en el nivel alto y del 7,1% en el nivel bajo y una precisión absoluta del 11,3% en el nivel alto y del 8,1% en el nivel bajo.
