Abra el software LightBox para la adquisición de imágenes. Para seleccionar los conjuntos de láser y filtros, utilice los parámetros de un tinte naranja seleccionando el colorante utilizado en la tinción de la lista de tintes. Usando una descripción general, haga clic en vivo para enfocar las celdas.
Una vez que las celdas estén enfocadas, ajuste la configuración de adquisición confocal. A continuación, seleccione el botón ROI rectangular y cree una región de interés alrededor de una mitocondria de interés haciendo clic y arrastrando para dar forma a la región. Para ajustar la compuerta del detector para el agotamiento de las emisiones estimuladas o la adquisición de estaciones, junto al menú general, seleccione el menú de compuertas o haga clic y mantenga presionado para agregar el menú a la vista.
Para la adquisición de estaciones, ajuste el láser de excitación al 15 al 20 % y el láser de agotamiento de la posición al 20 al 25 % con acumulaciones de 10 líneas. Utilice un tiempo de permanencia de píxeles de cuatro microsegundos y un tamaño de píxel de 20 a 25 nanómetros. Realice un lapso de tiempo seleccionando el menú desplegable de tiempo y, a continuación, estableciendo el número de iteraciones en cinco y un intervalo de tiempo de 25 o 30 segundos.
Se puede tomar una pila Z usando la opción de volumen y ajustando el rango de volumen Z deseado y el tamaño del paso. Software de deconvolución de imágenes de lugar abierto para deconvoluar imágenes de sitio sin procesar con el algoritmo de software. Después de asegurarse de que los parámetros microscópicos sean correctos, seleccione el botón express y establezca el tipo de deconvolución demasiado rápido, estándar, agresivo o conservador para diferentes grados de potencia de deconvolución.
Ejecute la deconvolución. Guarde las imágenes en formato ICS2. En la imagen J, haga clic en archivo y luego en abrir para abrir los archivos ICS2 desde el software de deconvolución.
Seleccione complementos, luego segmentación seguida de segmentación de Weka entrenable para abrir las imágenes de lugar deconvolutadas en el complemento de segmentación de Weka entrenable. En la configuración de segmentación, seleccione las funciones de desenfoque gaussiano, proyecciones de membrana y filtro sobel. Etiqueta una clase como crestas y la otra como fondo.
A continuación, dibuje una línea sobre la estructura para asignarla a cualquiera de las clases. A continuación, seleccione el botón Añadir en el lado derecho para las crestas o el fondo. A continuación, seleccione el botón clasificador de trenes en el lado izquierdo para generar un mapa basado en la información proporcionada al complemento.
Haga clic en el botón Guardar clasificador para guardar la configuración del clasificador para una segmentación futura. Utilice el mapa de probabilidad de crestas para umbralizar la imagen en la imagen J para generar una máscara binaria y, a continuación, vaya a analizar y, a continuación, analice las partículas. Finalmente, dibuje una línea de varios puntos, ajuste el grosor de la línea a varios píxeles de ancho y estline la línea para que se ajuste a las mitocondrias.
En este estudio, las imágenes de las mitocondrias en ácido retinoico indiferenciado diferenciaron las células SH-SY5Y con imágenes de lapso de tiempo, como se muestra. Las imágenes de posición deconvoneadas se pueden utilizar para determinar la periodicidad de las crestas en un área determinada y las mediciones de tamaño y forma de las crestas.
