Preparar la muestra para el cultivo de perfusión utilizando el biorreactor impreso en 3D. En una cabina de flujo laminar, coloque las muestras aisladas de la arteria carótida porcina en un medio de transporte frío. Con una hoja de bisturí, retire el exceso de tejido conectivo y recorte los extremos del tejido.
A continuación, lave el pañuelo dos veces en medios de transporte fríos. A continuación, coloque el tejido en un medio de transporte en un agitador orbital durante un mínimo de 30 minutos para un lavado final completo. Después de eso, conecte un segmento no ramificado de la arteria lavada al sistema de biorreactor fabricado utilizando dos conexiones de señuelo de púas.
Y asegúrelo con una unión de vasos hecha de lazos de silicona vascular. Usando una jeringa pequeña conectada a la primera conexión del señuelo, haga fluir suavemente el medio a través de la arteria para asegurar su permeabilidad. Después de asegurar la arteria al inserto fabricado, llene el espacio de reacción con medios de perfusión.
A continuación, llene cuidadosamente el circuito de circulación luminal con medios, eliminando cualquier resto de aire del sistema. Por último, conecte el espacio de reacción al sistema de perfusión ensamblado, completando la circulación. Para realizar el cultivo de perfusión, coloque el sistema de perfusión en una incubadora.
Después de conectarlo a una bomba peristáltica, conecte cualquier sistema de adquisición adicional, como sensores de presión. Permita que el sistema se equilibre durante la noche con un bajo caudal de medios de aproximadamente 10 a 15 mililitros por minuto. Al día siguiente, aumente gradualmente el caudal hasta alcanzar un caudal final de 35 mililitros por minuto.
Cada tres días, reemplace el 50% del medio conectando una jeringa con medio nuevo al puerto de intercambio de medios más cercano a la bomba y una jeringa vacía al puerto más cercano al depósito para recoger el medio gastado. Después del experimento, utilizando tijeras quirúrgicas estériles, recoja el tejido de la cámara de reacción recortando los extremos del tejido conectados al biorreactor. Las imágenes confocales utilizando marcadores específicos del músculo endotelial y liso revelaron que la estructura normal de una arteria estaba bien conservada y mantenida en todo momento, desde el momento de la cosecha, hasta la limpieza y el procesamiento, e incluso después del cultivo de perfusión.
Sin embargo, el manejo incorrecto durante el procesamiento resultó en la pérdida del endotelio antes del cultivo, y la aplicación de condiciones de cultivo no fisiológicas, como el inicio abrupto de alto flujo, mostró daño luminal. La evaluación histológica del tejido mediante tinción de hematoxilina y eosina y tinción de inmunofluorescencia en el momento de la cosecha y después de siete días de cultivo de perfusión reveló que la morfología y la distribución general de las células en la pared del vaso se mantuvieron en todo momento.
