Comience recolectando semillas de soja silvestre, S.Americanum y la variedad local de calabaza. Siembre las semillas en vermiculita a una profundidad de un centímetro y riéguelas bien. Cultívalos en una cámara de crecimiento a aproximadamente un 70% de humedad relativa.
Retire la cepa K599 de A.rhizogenes del congelador a 80 grados centígrados y actívela en un medio sólido LB a 28 grados centígrados durante 48 horas. A continuación, seleccione un solo clon de la cepa K599 y cultívelo en un mililitro de antibiótico líquido que contenga medio LB durante 12 horas. Extienda 500 microlitros de la suspensión bacteriana de manera uniforme sobre un antibiótico sólido que contenga medio LB e incube a 28 grados centígrados durante 24 horas.
Después de siete días, cuando los cotiledones de las plántulas estén desplegados, use un bisturí afilado esterilizado para cortar aproximadamente de 0,5 a un centímetro del hipocótilo. Deseche la raíz primaria y una parte del hipocótilo. Cubra la incisión del hipocótilo con la bacteria K599.
Plante plántulas en vermiculita húmeda e infecte 30 plantas de cada especie utilizando la transformación de raíces peludas mediada por A. rhizogenes. A continuación, riegue las plantas con cinco mililitros de suspensión bacteriana K599 resuspendida en medio básico Gamborg B5 de un cuarto de concentración. Cubre las macetas con una bolsa de plástico transparente y colócalas en una cámara de crecimiento.
Cultive las plantas durante aproximadamente 12 días después de la inoculación. En este momento, se deben generar nuevas raíces pilosas en el sitio de la incisión, que generalmente alcanzan longitudes de dos a cinco centímetros. Utilizando un sistema de imágenes de luminiscencia CAMI con luz de excitación verde a 540 nanómetros y emisión a 600 nanómetros, detecte la expresión del gen reportero DsRed2.
Se visualizan las raíces de plantas compuestas de soja silvestre, S.Americanum y calabaza bajo luz de excitación natural y verde.
