Para comenzar, prepare de 10 a 20 microgramos de ARN total de alta calidad para el aislamiento de ARN poli(A)enriquecido. Transfiera una alícuota de ARN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros libre de nucleasa. Incuba el tubo en un bloque térmico a 70 grados centígrados durante cinco minutos y luego colócalo en hielo durante dos minutos.
Después de volver a suspender las perlas de oligo(dT), transfiera el volumen requerido de suspensión de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y colóquelo en el imán durante tres minutos hasta que las perlas magnéticas formen un gránulo. Retire el sobrenadante y agregue un volumen igual de tampón de lisis. Vuelva a suspender las cuentas.
Vuelva a colocar el tubo en el imán durante tres minutos y retire el sobrenadante. Para la primera ronda de purificación, agregue tampón de lisis al tubo de muestra de ARN y mezcle bien. A continuación, transfiera la mezcla a las perlas de oligo(dT) y vuelva a suspender el pipeteo completo al menos 10 veces.
Deje que las muestras se incuben con rotación continua a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, coloque la muestra en un imán durante cinco minutos o hasta que el sobrenadante esté claro. Deseche el sobrenadante.
Agregue 600 microlitros de tampón de lavado a las perlas y mezcle con cuidado para volver a suspender. A continuación, agregue 300 microlitros de tampón de lavado dos a las perlas y mezcle con cuidado para volver a suspender. Coloque el tubo en el imán durante cinco minutos o hasta que el sobrenadante esté claro.
Deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 30 microlitros de tris HCL frío de 10 milimolares al tubo de muestra e incube a 70 grados centígrados. Después de cinco minutos, transfiera rápidamente el tubo al imán.
Y cuando la suspensión esté clara, transfiera el sobrenadante que contiene el ARN poli(A)enriquecido eluido a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para la segunda ronda de purificación, agregue 120 microlitros de tampón de lisis a la muestra de ARN eluido y mezcle bien. Lave las perlas utilizadas en la primera ronda de purificación con un volumen igual de tampón de lisis.
Pipetee 10 veces para volver a suspender las perlas y luego coloque el tubo en el imán durante cinco minutos antes de desechar el sobrenadante. Transfiera la mezcla de tampón de lisis de ARN a las perlas lavadas y mezcle bien mediante pipeteo. Después de lavar las perlas como se demostró anteriormente, agregue 25 microlitros de tris HCL frío de 10 milimolares al tubo de muestra e incube a 70 grados centígrados.
Después de cinco minutos, transfiera rápidamente el tubo al imán y, cuando la suspensión esté clara, transfiera el sobrenadante que contiene ARN poli(a)enriquecido eluido a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, para la conversión de bisulfito, transfiera 19 microlitros de muestra de ARN enriquecido con poli(A) purificado a un tubo de ocho tiras de 0,2 mililitros y agregue un microlitro de control de pico en la proporción predeterminada de una a 10.000 cantidades. Después de agregar 130 microlitros de reactivo de conversión a los tubos y mezclarlos bien, coloque el tubo en la máquina de PCR e inicie el programa de PCR.
Después de la PCR, coloque la columna en el tubo de recolección y agregue 250 microlitros de tampón de unión de ARN a la columna. A continuación, transfiera 150 microlitros de muestra tratada con bisulfito a la columna y pipetee bien. Agregue 400 microlitros de etanol al 95 al 100% a la columna, cierre rápidamente la tapa e invierta varias veces.
Después de centrifugar, lavar y neutralizar repetidamente con tampón de disulfonación, transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue de 20 a 30 microlitros de agua libre de nucleasa a la columna y déjela reposar durante un minuto. Centrifugar a 10.000 G durante 30 segundos a 25 grados centígrados y transferir 2,2 microlitros de sobrenadante a ocho tubos de tiras para evaluar la cantidad y calidad del ARN.
La eficiencia del enriquecimiento de poli(A)ARN se evaluó mediante un ensayo de ARN total por electroforesis capilar, lo que resultó en una disminución de la contaminación por ARN ribosómico después de la doble purificación en líneas celulares de cáncer de páncreas. La cantidad de ARN antes y después del tratamiento con bisulfito se evaluó mediante electroforesis capilar. Después del tratamiento con bisulfito, la distribución del tamaño del ARN mostró un pico de 200 a 500 nucleótidos debido a la fragmentación causada por la reacción del bisulfito.
La electroforesis capilar del amplicón mostró una preparación exitosa de la biblioteca con un cebador mínimo restante y sin pico de sobreamplificación. Después de que las lecturas de secuenciación se alinearon con la secuencia de referencia, el promedio de 2, 440 de las lecturas totales se asignó a la secuencia de picos, y la tasa de conversión total de C a T analizada alcanzó un promedio de 99.81%
