Para comenzar, use una cortadora de mandolina para cortar manzanas McIntosh en rodajas de ocho milímetros de grosor. Corta el tejido de hipantio de las rodajas de manzana en cuadrados de cinco por cinco milímetros. Colocar las muestras cuadradas en SDS al 0,1% durante dos días para descelularizarlas.
Después de la incubación, lavar las muestras con agua desionizada e incubarlas durante la noche en cloruro de calcio 100 milimolares a temperatura ambiente. A continuación, esterilice estos andamios en etanol al 70% durante 30 minutos. Lávelos con agua desionizada y colóquelos en una placa de cultivo de 24 pocillos.
Para la siembra celular, utilice MC3T3-E1 subclon 4 células mantenidas en placas tratadas con cultivo celular de 10 centímetros de diámetro en condiciones de cultivo celular. Preparar también un medio de cultivo celular compuesto por alfa MEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino o FBS y un 1% de penicilina en estreptomicina. Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia, separarlas de las placas de cultivo mediante tripsinización.
Centrifugar la suspensión celular a 200 g durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en alfa MEM. A continuación, pipetear una alícuota de 40 microlitros de la suspensión celular en la superficie de los andamios y dejar que las células se adhieran durante una hora en condiciones de cultivo celular.
Posteriormente, agregue dos mililitros de medio de cultivo a cada pocillo de cultivo. Reponga el medio de cultivo cada dos o tres días durante 14 días. Después de 14 días, prepare el medio de diferenciación agregando 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico y cuatro milimolares de fosfato de sodio al medio de cultivo celular.
Agregue este medio a la placa de cultivo. Incubar los andamios durante cuatro semanas para inducir la diferenciación de las células MC3T3-E1 y reponer el medio cada tres o cuatro días.
