Para comenzar, lave los andamios de manzana descelularizados con solución salina tamponada con fosfato. Para medir el tamaño de los poros, incubar los andamios en un mililitro de solución blanca de calcofluor al 10% durante 25 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de lavar los andamios con PBS, use un microscopio de escaneo láser confocal resonante de alta velocidad y establezca la configuración del filtro de emisión láser.
Ajuste la potencia del láser y el detector manualmente para garantizar una adquisición óptima de la imagen. Adquiera una pila Z de 20 imágenes con un tamaño de paso de cinco micrómetros. A continuación, en el software ImageJ, utilice la función Z project to maximum intensity para crear una imagen y aplique la función de búsqueda de bordes para resaltar el borde de los poros.
Traza los poros manualmente con la herramienta de selección a mano alzada. Ajusta cada poro como una elipse y mide la longitud del eje mayor. Recopila todas las medidas y calcula la longitud media.
Para el análisis de la distribución celular, después de lavar los andamios sembrados con células cultivados en el medio apropiado tres veces con PBS, fijarlos con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. A continuación, lave bien cada andamio con agua desionizada, permeabilice las células con una solución de Triton X-100 durante cinco minutos y vuelva a lavar con PBS. Incubar los andamios en un mililitro de ácido perjudico al 1% durante 40 minutos y enjuagar con agua desionizada.
A continuación, incube los andamios sumergiéndolos completamente en un mililitro de solución de tinción. Lave los andamios con PBS y tiña los núcleos celulares incubando los andamios en una solución DAPI de cinco miligramos por mililitro durante 10 minutos en la oscuridad. Vuelva a lavar bien y guarde los andamios en PBS.
Imagine los andamios sembrados de células con un microscopio de barrido láser confocal resonante de alta velocidad con un aumento de 10X utilizando la configuración que se muestra aquí. Ajuste la potencia del láser y el detector manualmente para garantizar una adquisición óptima de imágenes y adquiera una pila Z de 20 imágenes con un tamaño de paso de cinco micrómetros. A continuación, utilice el software ImageJ para procesar las imágenes confocales y utilice la función de proyección Z a máxima intensidad para crear una proyección máxima en el eje z para el análisis de imágenes.
La cuantificación de las imágenes de microscopía confocal demostró una distribución del tamaño de poro entre 73 y 288 micrómetros con un promedio de alrededor de 154 micrómetros. La mayoría de los poros oscilaban entre 100 y 200 micrómetros. Después del cultivo en el medio de diferenciación, se observaron depósitos minerales en los andamios.
Los andamios sembrados con células mostraron una coloración blanca opaca que sugiere mineralización, que no se observó en los andamios en blanco. Además, el análisis de microscopía de barrido láser confocal reveló una distribución celular homogénea dentro de los andamios.
