Para extraer metabolitos intracelulares del holobionte liofilizado, agregue 400 microlitros de metanol 100% frío con patrones internos al holobionte liofilizado. Luego agregue 10 miligramos de perlas de vidrio lavadas con ácido y coloque el tubo en un molino de perlas previamente enfriado. Inserte a 50 hercios durante tres minutos.
Después de la lisis, agregue 600 microlitros de metanol frío y vórtice durante un minuto. Coloque el tubo en una coctelera a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Para extraer metabolitos de células simbiodiniacae liofilizadas separadas, agregue 200 microlitros de metanol frío con patrones internos a las células simbiodiniacae secas.
Luego agregue perlas de vidrio lavadas con ácido y coloque el tubo en un inserto de molino de perlas preenfriado a 50 hercios. Después de tres minutos, agregue 800 microlitros de metanol y vórtice durante 30 segundos. Para la extracción de metabolitos del tejido huésped liofilizado separado, agregue un mililitro de metanol frío que contenga patrones internos al material huésped seco y al vórtice durante 20 segundos.
A continuación, coloque el tubo en un soporte de tubo flotante para la sonicación a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, para la purificación del extracto de metabolitos, centrifugar todas las muestras a 3000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros sin alterar el gránulo.
Vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de metanol frío al 50% y vórtice vigorosamente durante un minuto. Centrifugar de nuevo, luego recoger y agrupar los extractos polares sobrenadantes con los extractos semipolares de la misma muestra. Centrifugar los extractos agrupados a 16, 100 g durante 15 minutos para eliminar los precipitados.
Para el análisis, alícuota 50 microlitros de cada extracto en un inserto de vidrio y concentrar usando un concentrador de vacío durante 30 minutos a 30 grados centígrados. El análisis de GCMS reveló 107 metabolitos anotados en todos los tratamientos, incluido un conjunto de aminoácidos, ácidos orgánicos, carbohidratos, ácidos grasos y estériles. K significa que el agrupamiento identificó tres grupos distintos de muestras.
Las muestras de holobiontes fueron intermedias entre las fracciones separadas del huésped y del simbionte. Aunque K significa distribuciones de conglomerados, las coordenadas paralelas y la visualización del mapa de calor en la abundancia relativa del metabolito indicaron que el perfil de holobiontes coincidía más estrechamente con el perfil de la fracción del huésped difería significativamente de los perfiles del huésped y del simbionte. Los perfiles de huésped y simbionte fueron significativamente distintos entre sí con 100 metabolitos individuales, significativamente diferentes entre las fracciones huésped y simbionte.
