Para comenzar, coloque el chip y el portador de chip en la base de chip ubicada en una placa de cultivo de tejidos estéril y manténgalo a un lado en la campana de cultivo de tejidos mientras prepara el reactivo de activación del chip. Agregue un mililitro de la solución de CR2 al vial que contiene el polvo de CR1. Transfiera la solución del vial a un tubo de 15 mililitros envuelto en papel de aluminio.
Repita este proceso hasta que se hayan enjuagado cuatro veces y se hayan enjuagado cuatro mililitros de CR2 a través del vial de CR1. Para el último enjuague, tape el vial e inviértalo para eliminar el polvo residual. A continuación, agregue seis mililitros de CR2 al tubo de 15 mililitros que contiene CR1.
Mezclar la solución final de 10 mililitros con una pipeta sin introducir burbujas. Con una punta de pipeta de 200 microlitros, agregue 20 microlitros de solución de CR1 a la entrada del canal inferior del chip hasta que la solución comience a salir por la salida del canal inferior. Agregue 50 microlitros de solución de CR1 a través de la entrada del canal superior hasta que la solución comience a salir por la salida del canal superior.
Luego, coloque las papas fritas bajo luz ultravioleta durante 15 minutos. Después de la exposición, retire cualquier solución de CR1 de los canales superior e inferior. Lavar ambos canales con 100 microlitros de solución de CR2.
A continuación, lavar dos veces con 100 microlitros de DPBS. Prepare las soluciones de matriz extracelular para los canales superior e inferior del chip. Agregue 50 microlitros de solución de matriz extracelular a la entrada del canal inferior hasta que aparezca la gota en la salida.
Luego, agregue 50 microlitros a la entrada del canal superior hasta que aparezca la gota en la entrada. Agregue DPBS al depósito de la cuna de virutas. Coloque la tapa en el plato e incube las fichas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en la incubadora.
Al día siguiente, enjuague el epitelio o el canal superior del chip con 100 microlitros de medios de expansión de chip precalentados. A continuación, enjuague el endotelial o el canal inferior con 100 microlitros de medios HIMEC precalentados. Después de contar, agregue 10 microlitros de HIMEC al canal endotelial.
Si es necesario, agregue medios de crecimiento de organoides o medios de expansión de chips al canal epitelial y verifique la densidad de siembra de los HIMEC. A continuación, invierta el chip en la base del chip colocada en la placa de cultivo celular, agregue DPBS al depósito en la base del chip y coloque el chip a 37 grados Celsius durante dos o tres horas para permitir que los HIMEC se adhieran a la membrana del chip. Después de la incubación, vuelva a colocar la base de la viruta en posición vertical.
Lave suavemente el canal endotelial con 100 microlitros de medio HIMEC tibio y el canal epitelial con medios de crecimiento de organoides o medios de expansión de chips, dejando el medio en el canal. Para la recolección de enteroides, aspire suavemente el medio y lave los pocillos que contienen hidrogel de matriz de cultivo celular con 500 microlitros de DPBS tibio. Agregue 250 microlitros de solución de recuperación de celdas frías a cada pocillo y rasque el fondo de cada pocillo con una punta de pipeta nueva para interrumpir el hidrogel de la matriz de cultivo celular.
Agregue la suspensión celular interrumpida a un tubo frío de 15 mililitros sobre hielo e incube durante 45 minutos. Después de la incubación, centrifugar la suspensión y eliminar el sobrenadante. Luego, agregue dos mililitros de medio de disociación enteroide tibio al gránulo y coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Durante 60 a 120 segundos, a continuación, agregue 10 mililitros de medios de lavado de pañuelos fríos al tubo. A continuación, centrifugar y eliminar el sobrenadante antes de volver a suspender el gránulo en 200 microlitros de medio de expansión de virutas. Con una pipeta P200, disocie los enteroides y agregue la suspensión en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Cuente las celdas y ajuste el volumen del medio de expansión de la viruta para lograr una concentración de seis veces 10 a las seis celdas por mililitro. Luego, agregue 30 microlitros de suspensión celular resuspendida al canal superior del chip. Después de devolver las virutas a la cuna de las virutas, agregue DPBS al depósito e incube las virutas durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, enjuague el canal epitelial dos veces con 100 microlitros de medio de expansión del chip y el canal endotelial con 100 microlitros de medio HIMEC. A continuación, añada dos mililitros del medio de expansión del chip al depósito de entrada del canal superior y 300 microlitros al depósito de salida del canal superior. Agregue dos mililitros del medio HIMEC al depósito de entrada del canal inferior y 300 microlitros al depósito de salida del canal inferior.
Prepara las vainas y agrega las papas fritas a las vainas. A continuación, agregue los pods al módulo de cultivo. Establezca un caudal de 30 microlitros por hora e inicie el ciclo.
Las células epiteliales intestinales cultivadas utilizando el intestino neonatal en un chip formaron una monocapa de células confluentes y, posteriormente, se desarrollaron en una estructura tridimensional madura similar a una vellosidad. La adición de un microbioma disbiótico de un neonato con enterocolitis necrotizante grave al intestino neonatal en un modelo de chip mostró una mayor expresión de TNF-alfa en comparación con el control.
