Para comenzar, tome un mililitro de un cultivo de células de levadura en gemación de fase logarítmica media, que exprese HyPer7 dirigido a las mitocondrias. Centrifugar las células a 6.000 G durante 30 segundos y retirar el sobrenadante, dejando de 10 a 20 microlitros en el tubo. Vuelva a suspender el gránulo celular mezclándolo suavemente con los medios residuales con una micropipeta.
A continuación, use un soplador de aire o un pañuelo de papel sin pelusa para limpiar un portaobjetos de microscopio de vidrio y agregue 1,8 microlitros de la suspensión celular al portaobjetos. Por último, cubra las celdas con el cubreobjetos de vidrio número 1.5 bajándolo lentamente en ángulo para evitar la introducción de burbujas. A continuación, coloque el portaobjetos en la platina del microscopio.
Para obtener imágenes de las células, configure las condiciones de adquisición para garantizar una señal detectable y una resolución aceptable en cada canal de fluorescencia. Por ejemplo, en un microscopio confocal de disco giratorio con una cámara sCMOS, utilice un binning de 2x2, una potencia láser del 20 al 40 % y una exposición de 200 a 600 milisegundos. A continuación, examine el histograma de la imagen.
En una imagen de 12 bits, asegúrese de que el rango dinámico total de los valores de píxel sea de al menos varios cientos de niveles de gris sin saturación. Además, asegúrese de que el rango sea un orden de magnitud más alto que el nivel de ruido. Para calcular el nivel de ruido, mida la desviación estándar de los valores de píxel en un área libre de celdas de una imagen.
A continuación, recopile imágenes de lapso de tiempo sin demora entre adquisiciones para evaluar los efectos de las condiciones de imagen en la estabilidad de la señal y el estrés oxidativo en las mitocondrias. Con el software de adquisición del microscopio o ImageJ, mida el valor promedio de píxeles en cada canal de fluorescencia para garantizar la estabilidad de la señal. Si el experimento no incluye imágenes de lapso de tiempo, asegúrese de que la fluorescencia sea estable durante dos o tres pilas Z repetidas.
Adquiera imágenes con un intervalo Z de 0,5 micrómetros en una profundidad total de pila de seis micrómetros para levadura en ciernes. Si recopila pilas Z, asegúrese de que el intervalo Z sea el mismo para todas las imágenes del conjunto de datos e incluya toda la celda. También adquiera imágenes de luz transmitida para documentar los límites de las celdas.
