Comience normalizando las muestras de proteína lagrimal humana a 50 microgramos de proteína. Luego agregue 200 milimolares de ditiotreitol, o DTT, a una concentración final de 20 milimolares de DTT, incubado a 95 grados Celsius durante 10 minutos. Después de enfriar la solución proteica a temperatura ambiente, agregue 400 milimolares de yodoacetamida a una concentración final de 40 milimolares, luego incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos.
A continuación, agregue un 12% de ácido fosfórico acuoso en una proporción de uno a 10, lo que da como resultado una concentración final del 1,2%. Agite la mezcla brevemente para mezclar la solución. Agregue tampón de unión a proteínas en una proporción de uno a seis antes de volver a vórtice.
Destape la microcolumna de centrifugación que atrapa la suspensión y ensamble la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros para recoger el flujo. Agregue hasta 200 microlitros de mezcla de lisado de proteínas acidificadas en la columna. Centrifugar la columna a 4000 G durante 20 segundos.
A continuación, agregue 150 microlitros de tampón de unión a proteínas y centrifugue como antes para lavar la proteína suspendida. Ensamble la microcolumna de atrapamiento de suspensión en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue con cuidado 20 microlitros de tampón de digestión TEAB en el filtro dentro de la columna de centrifugado, evitando burbujas y espacios de aire.
Tape de forma segura la columna de microgiro que atrapa la suspensión para evitar la evaporación. Incubar a 47 grados centígrados durante una hora en un mezclador térmico sin agitar. Péptidos eluidos con 40 microlitros de TEAB de 50 milimolares.
Luego centrifugue a 4000 G durante 20 segundos. Ahora agregue 40 microlitros de ácido fórmico al 0,2% y centrifugue como antes. Por último, añadir 35 microlitros de ácido fórmico al 0,2% y acetonitrilo al 50% antes de volver a centrifugar.
Tire de los tres eluyentes y séquelos con una centrífuga de vacío. Una vez secas, almacene las muestras a 80 grados centígrados para futuras analizaciones. La búsqueda de adquisición dependiente de los datos arrojó un total de 1183 más o menos 118 proteínas en el grupo de captura en suspensión, y 874 más o menos 70 proteínas al 1% de FDR en el grupo en solución.
El análisis de ontología génica reveló proteomas similares para ambos enfoques, con la función principal como actividad catalítica de unión y regulación de la función molecular.
