Para empezar, prepara las cuatro hojas de papel de filtro, cada una de 12,5 por 7,5 centímetros. Apile dos hojas juntas y coloque la pila en un búfer de transferencia para empaparla. Coloque la membrana de PVDF en etanol al 95% y agite la membrana sobre un balancín durante un minuto.
Recoge el etanol. Sumerja la membrana en el tampón de transferencia. Y agitar durante dos minutos.
A continuación, coloque la pila de papel de filtro de remojo sobre una superficie plana y móvil, como una tapa grande, y aplánela con un rodillo. Con un liberador de gel o pinzas, coloque con cuidado la membrana de PVDF en la pila. Luego, coloque una sola hoja de papel de filtro seco sobre esta membrana y deslice el rodillo sobre el papel para absorber cualquier exceso de tampón que se encuentre en la superficie de la membrana.
Levante el papel de filtro superior sin frotar contra la membrana. Tome muestras de fibra aisladas del congelador y descongélelas a temperatura ambiente antes de centrifugar y volver a suspender completamente la muestra. Coloque una gota de un microlitro de cada muestra en el centro del área designada de la membrana.
Evite tocar la membrana con la punta de la pipeta. Deje que las gotas de muestra se absorban completamente en la membrana durante 15 minutos. Luego, con un liberador de gel o pinzas, levante con cuidado la membrana de la pila de papel de filtro húmedo.
Colócalo sobre una hoja seca de papel de filtro y déjalo durante al menos cinco minutos para que se deshidrate. Reactive la membrana después de que las manchas de muestra se hayan vuelto completamente blancas. A continuación, proceda con el inmunomarcaje de la proteína diana.
Aprenda a utilizar la intensidad del panel de señales para clasificar la intensidad de las isoformas MHC y las señales de actina a partir de las imágenes de manchas de puntos. La detección de proteínas diana fuertes, medias y pequeñas se muestra mediante señales saturadas, moderadas y débiles, respectivamente. Para la identificación del tipo de fibra, compare inicialmente los resultados de la cadena pesada de miosina IIA y la cadena pesada de miosina uno.
Documente las fibras que muestran una sola isoforma de cadena pesada de miosina con una intensidad de señal saturada o moderada. Registre las fibras detectadas con actina y sin detección de miosina de cadena pesada uno o IIA como potencial tipo 2X. Si hay una débil señal de isoforma de cadena pesada de miosina con una señal de actina moderadamente desaturada, regístrela como no identificada.
Deseche las muestras con proteínas diana débiles o no detectadas. Las fibras que muestran señales saturadas o moderadas tanto de MHCIIA como de MHC1 no deben utilizarse para la preparación específica del tipo de fibra. Después de la identificación de MYO1D, prepare muestras de tipo uno y dos combinando fibras con señales saturadas o moderadas para la isoforma MHC respectiva.
Utilice 10 microlitros de cada muestra específica del tipo de fibra y sepárelos en una página de gel prefabricado por SDS, siguiendo las pautas del fabricante. Utilice un generador de imágenes en gel para detectar la isoforma MHC objetivo, siguiendo el protocolo del fabricante. Compare la intensidad de la señal de cada isoforma MHC en todas las muestras específicas del tipo de fibra.
La identificación del tipo de fibra se confirma mediante la isoforma MHC correcta a una intensidad de señal moderada o saturada. El inmunomarcaje del dot blot permitió la identificación de fibras tipo dos, fibras tipo uno y fibras potenciales tipo 2X. Las muestras específicas del tipo de fibra se validaron, utilizando western blot y anticuerpos específicos de cadena pesada de miosina.
