Después de construir y alinear el sistema de microscopio de dos fotones sensible a la polarización, de acuerdo con la representación esquemática mostrada, pruebe la calidad de la alineación óptica con una muestra de referencia isotrópica como la fluoresceína incorporada en un polímero amorfo. Para ello, encienda el láser de excitación y mida los gráficos polares de 360 grados de la muestra de referencia para obtener una placa de media onda cero. Ajuste el ángulo de la placa de media onda para que corresponda a los ejes X e Y del plano de muestra, y compruebe si ambos fotodiodos recogen intensidades similares de dos componentes de emisión excitados por fotones.
Para analizar la muestra, monte el portaobjetos de vidrio con este espécimen de esferulita en la platina piezoeléctrica, asegurándose de que la cara del portaobjetos que contiene el cubreobjetos se enfrente al objetivo de inmersión de alta apertura numérica. A continuación, asegure el portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva. A continuación, ajustando las posiciones X, Y y Z con las perillas del microscopio, enfoque el objetivo en la esferulita en la solución.
Concéntrese específicamente en el área central de toda la estructura, ya que los diámetros de la esferulita suelen estar en el rango de decenas de micras. A continuación, centre esta esferulita en el campo de visión en el plano del microscopio. Determine el tamaño del escaneo XY ajustando el número de pasos de la etapa piezoeléctrica en las direcciones X e Y para cubrir toda el área de la estructura.
Ajuste los parámetros de la etapa piezoeléctrica, como la velocidad de escaneo, el tamaño del paso y el rango, para cubrir el área de toda la esferulita. Abra el obturador, encienda los fotodiodos y recoja los componentes de emisión X e Y de intensidad de fluorescencia excitada por dos fotones para cada paso del área de escaneo seleccionada para el haz de excitación polarizado correspondiente a los ejes X e Y. A continuación, escanee esta muestra de esferulita, lo que dará como resultado una fluorescencia excitada por dos fotones.
Para realizar un análisis de polarización completo desde el punto específico de la muestra, apague el haz de excitación. Tome las coordenadas específicas de la etapa piezoeléctrica correspondientes a la ubicación elegida en esta esferulita donde se requiere la información sobre la orientación de las moléculas con la resolución submicrónica. Ajuste la platina piezoeléctrica para centrar el campo de visión en las coordenadas X e Y indicadas.
Después de encender el haz de excitación, encienda la rotación de 180 grados de la placa de media onda para realizar un análisis completo de polarización de 360 grados de los componentes de emisión X e Y de la emisión de fluorescencia excitada de dos fotones. La imagen de la esferulita de insulina obtenida después de realizar un escaneo de trama 2PFM fue consistente con las reportadas para una esferulita. También se verificó la posición de la placa de media onda correspondiente a la excitación de la muestra a lo largo de los ejes X e Y.
Los gráficos polares cambiaron mientras se realizaba un análisis completo de polarización desde diferentes puntos seleccionados. Fuera de la esferulita, el gráfico PLO parecía una colección de artefactos y picos aleatorios de ruido de señal. Los polígrafos medidos correctamente desde ubicaciones altamente ordenadas a lo largo de los ejes X e Y tenían diferentes formas y geometrías dependiendo de la orientación local y la organización de los fluoróforos.
