Para empezar, utilice unas tijeras o tijeras de alta resistencia para cortar el extremo de la tapa a 0,5 milímetros de la parte inferior cónica de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Coloque un trozo de lana de vidrio en el tubo cortado para cubrir el orificio central. Coloque una unidad de filtro de lana de vidrio ensamblada en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y etiquete el tubo.
A continuación, corte una placa de PCR de 96 pocillos sin faldón en seis bastidores de soporte de dos columnas. Voltee las rejillas de dos columnas para que los fondos cónicos de los pozos miren hacia arriba. Coloque la rejilla en una placa de Petri de vidrio que contenga papel de filtro húmedo y cúbrala con la tapa para crear una cámara de humedad para las vainas de las hojas.
Para cosechar conidios del Colletotrichum graminicola esporulado, agregue de tres a cuatro mililitros de agua desionizada estéril en el plato. Con un mortero de punta cónica estéril, raspe uniformemente todo el plato para aflojar las esporas del agar. Agregue asépticamente un mililitro de suspensión de esporas en una unidad de filtro de lana de vidrio y permita que las esporas fluyan hacia el tubo de recolección por gravedad.
Centrifugar la suspensión de esporas filtrada a 3.500 G durante cinco minutos y verter el líquido en un recipiente esterilizable en autoclave. Agregue un mililitro de agua desionizada estéril en el tubo de recolección y agite suavemente para volver a suspender las esporas granuladas. Nuevamente, centrifugar la suspensión y resuspender las esporas para su cuantificación en 300 a 500 microlitros de agua desionizada.
Utilice un hemocitómetro bajo un microscopio compuesto con un aumento de 100 veces para determinar la concentración de esporas. Luego prepare 500, 000 esporas por mililitro de suspensión con agua desionizada. Para quitar la vaina de la primera hoja verdadera de las plántulas de la segunda etapa.
Pase una uña del pulgar a lo largo del margen superpuesto de la funda y aflójela suavemente del conducto. Corta la vaina de la hoja recuperada en segmentos de tres a cinco centímetros. Desenrolle con cuidado cada segmento para exponer la capa epidérmica interna.
Aplique 20 microlitros de suspensión de esporas de hongos en la superficie interna en el centro de la vaina por encima de la nervadura media. Coloque las vainas de las hojas inoculadas horizontalmente, con una nervadura central colocada en la parte inferior, en una placa de Petri de vidrio que contenga papel de filtro humedecido. A continuación, coloque las pequeñas cámaras de humedad en una caja de almacenamiento transparente forrada con papel de germinación humedecido, cubra la caja de almacenamiento con una tapa e incube a 23 grados centígrados bajo iluminación continua durante el curso de tiempo previsto.
Revise regularmente las casillas en busca de signos de enfermedad en las vainas.
