Para empezar, con un bisturí, haz una incisión a lo largo de la línea media dorsal de un ratón sacrificado desde el occipital hasta la región sacra. Con un microscopio quirúrgico estereoscópico, diseccione cuidadosamente las capas hasta la columna lumbar. Identifica el último arco costal.
Identifica la última vértebra cervical y el sacro. Luego haz un corte para separar la columna vertebral. Con un par de pinzas de disección, realice una laminectomía dorsal de la vértebra para extraer la médula espinal.
Extirpar los nervios que emergen a través de los agujeros que constituyen el sistema nervioso periférico. Ahora, coloque la médula espinal extraída en una tabla de disección. Con unas tijeras vannas, córtalo en trozos de dos milímetros.
Luego transfiera las piezas a un microtubo de fondo plano de dos mililitros. Agregue un mililitro de solución de trabajo HBSS-LD al microtubo. Incubar la mezcla a 37 grados centígrados durante 25 minutos.
Asegúrate de hacer un vórtice vigoroso de la mezcla cada cinco minutos. A continuación, pasa el contenido de cada digestión por un colador de 40 micras. A continuación, añade siete mililitros de HBSS con un 2% de FBS para neutralizar la digestión y triturar el tejido restante.
Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros antes de centrifugarla a 220 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Ahora use una micropipeta de un mililitro para desechar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el gránulo en dos mililitros de HBSS-FBS en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Agregue dos mililitros de medio de gradiente de densidad isotónica al 90% al tubo y centrifugue la mezcla a 160 g durante 25 minutos a 18 grados centígrados. Finalmente, con una pipeta de transferencia, recupere la interfase y transfiérala a un tubo cónico de 15 mililitros. Lavar las células con 10 mililitros de PBS, luego centrifugar las células a 220 g durante cinco minutos a cinco grados centígrados antes de seguir experimentando.
La purificación de las células microgliales extraídas produjo hasta un 99% de rendimiento celular, como se confirmó mediante la tinción con FACS. Se observaron células doble positivas con un tamaño promedio de 10 micrómetros consistentes con microglía no activada.
