Para empezar, mantenga la esterilidad limpiando guantes, cartuchos y placas de cultivo con etanol al 70%. A continuación, encienda el compresor de la bioimpresora y seleccione el botón inicializado para inicializar la impresora. Limpie las superficies del interior de la impresora con etanol al 70 %.
Con el botón Tirada, cargue el archivo de impresión y abra el PDF del protocolo de impresión. Descongele la biotinta, los líquidos activadores y 50 mililitros de medios completos a temperatura ambiente. Prepare el cartucho de impresión como se indica en el protocolo de impresión PDF, asegurándose de que los volúmenes correctos de reactivos estén en los compartimentos especificados.
A continuación, agregue 1,2 mililitros de F3 a C1, 1,2 mililitros de F32 a C2 y 200 microlitros de F261 a C4. Retire la placa recubierta de polietilenia y laminina de la incubadora. Coloque el compartimento del soporte de la placa en una placa de perfil bajo. Inserte la placa en el compartimento derecho del soporte de la placa de la impresora.
Retire la tapa del plato y colóquela en el soporte de la tapa. Coloque el cartucho de impresión en la bioimpresora y seleccione el botón Print Inert Base para iniciar la tirada de impresión. Después de la descongelación, centrifugar las neuronas glutamatérgicas y los astrocitos, aspirar el sobrenadante y resuspender ambos tipos celulares por separado en un mililitro de medio completo.
Mezcle 20 microlitros de la suspensión celular con el mismo volumen de azul de tripano y cuente las células para determinar la concentración de células viables para cada tipo de célula. A continuación, combine 3 millones de neuronas glutamatérgicas con 1 millón de astrocitos en un tubo de 15 mililitros y agregue medios completos para obtener un volumen final de ocho mililitros. Centrifugar la suspensión celular y aspirar el sobrenadante sin alterar el gránulo.
Suspender el pellet en 200 microlitros de líquido activador F299 pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Coloque las tapas en el cartucho y la placa de cultivo y retírelas de la bioimpresora. En un gabinete de bioseguridad, agregue 200 microlitros de suspensión celular al pocillo C3 del cartucho de impresión.
Vuelva a insertar el cartucho en la bioimpresora y retire la tapa como se ha demostrado anteriormente. Inicie la etapa de modelos de impresión de la tirada. Al mismo tiempo, sustituya el material laminado de la placa de control 2D por un material completo.
Inserte la placa de orientación de bioimpresión en la bioimpresora y retire la tapa. Comience el proceso de segmentación de bioimpresión. Cuando se le solicite, retire la placa de orientación de la bioimpresora.
Utilice la guía para identificar los lugares donde se pueden observar gotas en la placa. Vuelva a insertar la placa de orientación en la bioimpresora para repetir el proceso de impresión y selección de gotas. Cuando se le solicite, sustituya la placa de orientación por una placa de cultivo celular.
Después de la impresión, agregue medios completos a todos los pocillos de cocultivo 3D e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Finalmente, deseche los cartuchos y los líquidos restantes. de acuerdo con los protocolos de laboratorio.
Después de siete días de impresión, casi no quedaban células individuales y los haces interconectados de neuritas y proyecciones astrocíticas parecían fortalecidos. El crecimiento de neuritas aumentó linealmente entre 12 y 156 horas. Durante el crecimiento de las neuritas, los grupos de cuerpos celulares también aumentaron de tamaño.
El análisis de viabilidad celular mostró que aproximadamente el 72% del total de células estaban vivas en el cuarto día, mientras que el 29% estaban muertas. La inmunotinción confirmó la morfología celular sana de las neuronas y astrocitos bioimpresos, y ambos tipos de células exhibieron crecimiento de protuberancias celulares. El fenotipo glutamatérgico de las neuronas se confirmó mediante inmunotinción para el receptor de glutamato 2.
