Para comenzar, use unas tijeras para cortar un pequeño trozo de papel para lentes y colóquelo en una placa de Petri. A continuación, vierta la formalina que contiene el cerebro fijo y la columna vertebral aislados de un ratón en un embudo forrado con papel de filtro. Transfiera el cerebro y la columna vertebral a una placa de Petri vacía.
Usa un bisturí para dividir el cerebro en seis partes coronales. Con unas pinzas, transfiera las muestras de cerebro a la mitad del papel de la lente en la placa de Petri. Corta la médula espinal en tres pedazos con el bisturí, luego corta la pieza de la espina sacra en el extremo caudal hasta que la médula espinal se haga visible.
Levante la columna torácica con la mano no dominante. Tome las pinzas de Adson con los dientes bien cerrados en la mano dominante y empuje suavemente el extremo hacia la abertura más pequeña de la columna vertebral con un suave movimiento de torsión. A continuación, con unas pinzas, tire suavemente de la médula espinal emergente fuera de la columna, coloque la pieza del cordón en la placa de Petri que contiene el papel de la lente.
Con un bisturí, divida tres piezas de la médula espinal en piezas transversales más pequeñas. Coloca estas piezas en la misma mitad del papel de la lente que contiene las piezas del cerebro. Dobla el papel de la lente para intercalar los trozos de pañuelo y colócalo en un casete etiquetado.
Transfiera el casete a un frasco de muestra que contenga formol. Después de la incubación, transfiera el casete del recipiente de muestras al primer baño de formalina en el procesador automático de tejidos y haga funcionar el procesador durante la noche. Al día siguiente, retire los casetes del procesador de pañuelos y transfiéralos a la cámara de retención caliente de la estación de inclusión de parafina, vierta la cera de parafina para cubrir el fondo del molde.
Con pinzas finas, coloque las piezas de la sección transversal de la corona cerebral y la médula espinal en la parafina en la parte inferior del molde. Transfiera el molde a la superficie de enfriamiento durante varios segundos para fijar el cerebro y las muestras en su lugar. Vuelva a colocar el molde en la superficie calentada y llénelo hasta arriba con parafina caliente.
Coloque la tapa del casete etiquetada con la identificación de la muestra en el molde. Vierta parafina encima de la tapa del casete. Transfiera el molde a la estación de enfriamiento para permitir que la cera se asiente.
Una vez que los bloques estén completamente fríos, asegúrelos en un micrótomo giratorio. Recorta los bloques y corta secciones de cinco micrómetros de cada bloque de parafina. Mueva la cinta de parafina a un baño de agua a 42 grados centígrados.
Recoja la sección del baño de agua en un portaobjetos etiquetado. Coloque los portaobjetos en una rejilla de plástico y hornee las secciones durante la noche a 37 grados centígrados en un horno seco. Después de escanear, abra la imagen J y, a continuación, arrastre y suelte la imagen tiff de la sección para su análisis.
Observar la sección de la médula espinal en cuatro cuadrantes y puntuar la presencia de lesiones de desmielinización en cada cuadrante. Esta sección tiene una puntuación de cuatro, porque hay lesiones en los cuatro cuadrantes. Esta sección puntúa uno, porque las lesiones solo están en un cuadrante.
La tinción de CD45 indica la presencia de leucocitos en las lesiones. Las lesiones nuevas contienen muchas células CD45 en comparación con las más antiguas. Por el contrario, las lesiones nuevas pueden contener menos axones positivos para SMI-32 en comparación con las lesiones más antiguas.
Los ratones del grupo de tipo salvaje desarrollaron EAE severa con parálisis completa. Mientras que el grupo OGR1-KO desarrolló enfermedad leve. Esta diferencia en la puntuación clínica correspondió a variaciones en las lesiones de desmielinización submeníngea, en el porcentaje de área de mielina teñida en la médula espinal, además, el porcentaje de fracción de mielina también difirió significativamente entre los ratones OGR1 y los de tipo salvaje y se correlacionó con la puntuación acumulada de EAE.
En la EAE, la inflamación en el cerebro se localiza principalmente en el cerebelo y el tronco encefálico. Pueden ser evidentes áreas adicionales de inflamación en el cerebro, incluso en las meninges, cerca de los ventrículos y en otras vías de la materia blanca, como el nervio óptico y el cuerpo calloso. La luz de neurofilamentos séricos medida con un ensayo de matriz de moléculas pequeñas detectó niveles más altos de luz de neurofilamentos séricos en ratones con EAE en comparación con ratones sanos y estos niveles elevados se correlacionaron con la densidad de SMI-32 positivo en la médula espinal.
