Para empezar, llene un vaso Dounce con dos mililitros de tampón de lisis de núcleos helado que contenga 0,01% de digitonina y agregue los trozos de tejido cerebral de ratón diseccionados en él. Usando un homogeneizador de tejido Dounce de vidrio, homogeneice el tejido 25 veces cada uno con los morteros A y B, y transfiera el homogeneizado resultante a un tubo de 15 mililitros. Añadir dos mililitros de tampón de lisis de núcleos helados que contenga 0,01% de digitonina al homogeneizado e incubar en hielo durante cinco minutos.
Luego, centrifuga los núcleos a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Con una micropipeta, retire el sobrenadante y agregue cuatro mililitros de tampón de lisis de núcleos helado que contenga 0,01% de digitonina. Filtre la suspensión de núcleos a través de un filtro celular de 40 micrómetros.
Centrifugar los núcleos de nuevo, eliminar el sobrenadante y añadir cuatro mililitros de tampón de tinción para lavar los núcleos. Después de filtrar la suspensión a través de un filtro celular de 40 micrómetros, granule los núcleos por centrifugación y vuelva a suspender los núcleos en un mililitro de PBS que contiene 0,04% de BSA e inhibidores de ARNasa. Para contar las células, mezcle 10 microlitros de azul de tripano al 0,4% con 10 microlitros de los núcleos en un tubo de 0,5 mililitros.
Cuente los núcleos utilizando un contador celular automatizado. Transfiera 100 microlitros de los núcleos a un tubo FACS para el control sin teñir. Agregue 10 microlitros de 7-AAD a los núcleos restantes e incube durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y proceda con la clasificación de núcleos usando FACS.
A continuación, transfiera 10 microlitros de los núcleos clasificados a un nuevo tubo FACS que contenga 90 microlitros de DPBS con un 2% de FBS inactivado por calor. Después de centrifugar los núcleos clasificados, retire el sobrenadante con una micropipeta y vuelva a suspender los núcleos en 100 microlitros de tampón de núcleos diluidos. Antes de la clasificación, la muestra contiene restos sustanciales con más del 99% de singletes positivos para tinción nuclear, lo que indica una lisis celular efectiva.
Los núcleos cerebrales después de la clasificación demostraron un aumento en la pureza del 36% inicial a casi el 100%
