Para comenzar, tome un vial que contenga las células madre hematopoyéticas y progenitoras de la médula ósea del ratón. Con una micropipeta, vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de tampón de lisado ACK e incube durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Transfiera la mezcla resuspendida a un tubo de 50 mililitros a través del filtro de celdas de 70 micrómetros previamente humedecido.
A continuación, añada 10 mililitros de tampón FACS para diluir el tampón de lisado ACK. Centrifugar la mezcla a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y resuspender el gránulo en 10 mililitros de tampón FACS resuspendiéndolo primero en un mililitro de tampón y luego rellenando con nueve mililitros de tampón. Ahora, mezcle 10 microlitros de azul de tripano al 0,4 % con 10 microlitros de las células en un tubo de 0,5 mililitros y cuente las células con un contador de células automatizado.
Para teñir las células, centrifugar las células a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el gránulo en tampón FACS para lograr una concentración final de una vez 10 a las siete celdas por mililitro resuspendiendo primero el gránulo en un mililitro de tampón y luego rellenando con el volumen restante. Con una micropipeta P1000, transfiera la suspensión a un tubo FACS a través de una tapa de filtro de celdas de 35 micrómetros.
A continuación, prepare la mezcla para teñir como se muestra aquí. Después de la centrifugación, resuspender la suspensión celular en 300 microlitros de mezcla de tinción en un tubo de muestra e incubar en hielo durante 15 minutos protegido de la luz. A continuación, añadir 300 microlitros de mezcla dos en el tubo de muestra e incubar durante 20 minutos sobre hielo protegido de la luz.
Agregue tres mililitros del tampón FACS a los tubos de muestra teñidos individuales y mezclados. Ahora centrifuga la suspensión celular. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en 500 microlitros del tampón FACS.
Prepare un tubo de 1,5 mililitros precargado con 500 microlitros de medio de recolección. Una vez que se haya calibrado el instrumento FACS, agregue 500 microlitros de tampón FACS a la suspensión celular y luego transfiera un mililitro de la muestra a través de una tapa de filtro celular de 35 micrómetros a un nuevo tubo FACS. Después de la clasificación de células, transfiera 10 microlitros de las células clasificadas a un nuevo tubo FACS que contenga 90 microlitros de tampón FACS.
Pellet la suspensión celular por centrifugación y resuspender en 50 microlitros de PBS con 0.04% BSA. Transfiera la suspensión a un tubo de 0,2 mililitros y agregue 50 microlitros de PBS con BSA al tubo original para recolectar las células sobrantes. Transfiera las células al tubo de 0,2 mililitros para alcanzar un volumen total de 100 microlitros.
Realice un experimento piloto para identificar el mejor tiempo de lisis para el aislamiento de núcleos. Después de peletizar los núcleos, vuelva a suspender el gránulo de núcleos en 12 microlitros de tampón de núcleos diluidos. Agregue dos microlitros de núcleos a un tubo que contenga 0,4 % de azul de tripano y ocho microlitros de PBS con 0,04 % de BSA y cuente los núcleos con un contador celular automatizado.
Después de completar el aislamiento de los núcleos, transfiera seis microlitros de resuspensión de núcleos a un nuevo tubo FACS precargado con 150 microlitros de tampón FACS. Agregue tres microlitros de 7-AAD e incube durante cinco minutos en hielo.
