Después de esterilizar en autoclave dos placas de silicona, en condiciones estériles, retire las placas de la bolsa del autoclave y colóquelas en placas de 150 milímetros. Agregue 400 microlitros de solución de fibronectina a cada pocillo de las placas de silicona. A continuación, vuelva a suspender las células estromales mesenquimales inducidas con escleraxis positiva en medio MSC y cuente las células viables utilizando un contador celular automatizado.
Calcule el volumen de suspensión celular requerido para obtener 1.25 por 10 a la cuarta celda por centímetro cuadrado. Retire este volumen de medio elástico MSC del tubo cónico de 15 mililitros y agregue el volumen requerido de suspensión de células estromales mesenquimales inducidas con escleraxia positiva. Invierta el tubo para homogeneizar la nueva suspensión celular.
Agregue 400 microlitros de suspensión celular a cada pocillo de ambas placas de silicona. Vuelva a colocar la tapa en las placas de 150 milímetros e incube las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para tensión uniaxial, enjuague el aparato de estiramiento con agua bidestilada, seguida de etanol al 70%.
Limpie el aparato, colóquelo en la campana de cultivo celular y expóngalo a la luz ultravioleta durante 15 minutos. A continuación, coloque una placa en la incubadora como control estático. Coloque la segunda placa de silicona asentada en el aparato de estiramiento alineando los tornillos con los orificios de la placa de silicona.
A continuación, coloque la tapa en el aparato. Conecte el aparato con la placa de silicona asentada a la fuente electrónica y colóquelo en la incubadora a 37 grados centígrados. Ajuste el programa de estiramiento cíclico al 4% de tensión sinusoidal en 0,5 hercios durante dos horas al día.
Inicie el estiramiento presionando el botón de inicio. Durante la carga mecánica de las células estromales mesenquimales inducidas por escleraxia positiva, las densidades de siembra excesivamente altas condujeron a la contracción celular prematura y a la muerte celular temprana. Después de varios días de estiramiento, se observó cierto grado de organización celular en el grupo de células estromales mesenquimales inducidas escleraxis positivas, en comparación con la organización celular aleatoria en el grupo estático.
La tinción con faloidina de los filamentos de actrones mostró que las células crecían perpendicularmente a la dirección del estiramiento, en contraste con la organización celular aleatoria observada en las placas estáticas. El análisis de la expresión génica reveló una regulación positiva significativa en los genes tenógenos tanto a los tres como a los siete días, en comparación con solo las IMSC en el día cero. La deposición de colágeno en los medios después de siete días de estiramiento fue significativamente mayor en el grupo de células estromales mesenquimales inducidas con escleraxia positiva estiradas en comparación con todos los demás grupos.