Para comenzar, coloque las secciones de tejido de la mucosa nasal de rata teñidas con hematoxilina y eosina en una platina de microscopio. Ajuste el enfoque del microscopio hasta que la imagen sea claramente visible. Capture la imagen del tejido a 40X.
Calienta el tampón de fosfato de citrato hasta que hierva. Luego agregue los portaobjetos al recipiente después de retirarlo del fuego. Después de calentar durante ocho minutos hasta que hierva, apague el fuego durante ocho minutos y posteriormente cambie a fuego medio bajo durante siete minutos.
Después de dejar que el recipiente se enfríe naturalmente, transfiera las rodajas a PBS. Use una coctelera decolorante para agitar las rodajas durante cinco minutos. A continuación, dibuje un círculo alrededor del tejido seco con un bolígrafo inmunohistoquímico.
Agregue una solución de peróxido de hidrógeno al 3% a las rodajas antes de incubar. Luego transfiera las rodajas a PBS para lavarlas como antes. Para bloquear, aplique suero de cabra al 5% dentro del círculo marcado.
Después de la incubación, retire con cuidado la solución de bloqueo y agregue uno o dos mililitros de FOXP3 a las rodajas de tejido. Luego coloque las rodajas en una cámara húmeda para la incubación durante la noche. Después de lavar las rodajas en PBS, seque suavemente las rodajas con papel de filtro.
A continuación, añada uno o dos mililitros de la solución de anticuerpos secundarios a las rodajas. A continuación, incube las rodajas en 100 microlitros de solución de trabajo de amplificación de señal de tiramida durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, lave las rodajas con PBS tres veces durante cinco minutos cada una.
Ahora aplique uno o dos mililitros de solución de tinción DAPI a las rodajas antes de la incubación. Apague la autofluorescencia incubando las rodajas en el enfriador durante cinco minutos antes de un lavado con PBS de 10 minutos. A continuación, séllalos con el extintor antifluorescente.
Capture las imágenes microscópicas de las secciones teñidas con aumentos de 20X y 40X. La tinción con hematoxilina y eosina de las ratas control mostró células epiteliales y cilios bien dispuestos. La mucosa del tabique nasal estaba dañada y desprendida en el grupo de enfermedad con notable infiltración de neutrófilos.
La tinción multiinmunofluorescente reveló que las expresiones de ROR Gamma T y TCAM1 estaban aumentadas en el grupo de la enfermedad. Sin embargo, FOXP3 estaba infraexpresado.
