Este trabajo contó con el apoyo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2021YJ0175).

El protocolo y los procedimientos experimentales han recibido la aprobación del Comité Administrativo y de Investigación Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Se obtuvieron comercialmente ratas macho Sprague Dawley (SD) de ocho semanas de edad, con un peso de 180-200 g (ver Tabla de Materiales) y se alojaron bajo un ciclo de luz/oscuridad natural con temperatura controlada (23 ± 2 °C) y humedad relativa (55% ± 10%). Doce ratas fueron divididas aleatoriamente en dos grupos: el grupo de control y el grupo de AR. Todas las ratas se aclimataron a estas condiciones y se les proporcionó acceso gratuito a comida y agua durante una semana antes del ensayo.
1. Establecimiento de un modelo de RA en ratas
<ol><li>Preparación de la solución sensibilizante: suspender 30 mg de ovoalbúmina (OVA) y 3 g de Al(OH)3 en 100 mL de suero fisiológico (ver Tabla de Materiales)14,15.</li>
	<li>Sensibilización básica: agarrar y sostener a la rata completamente despierta con el abdomen hacia arriba. Desinfecte el abdomen con bolas de algodón empapadas en alcohol al 75%. Utilice una jeringa de 1,5 ml para inyectar 1 ml de la solución sensibilizante preparada en el paso 1.1 en la cavidad abdominal izquierda de las ratas del grupo AR. Repita esta inyección una vez cada dos días durante 14 días (Figura 1A). NOTA: Asegúrese de que la cabeza de la rata esté colocada más abajo que su cola para evitar daños en los intestinos grueso y delgado al insertar la jeringa. El lugar de la inyección se encuentra a 1,5 cm de la línea media ventral. Las ratas del grupo control deben recibir inyecciones intraperitoneales de 1 ml de solución salina normal una vez cada dos días durante 14 días.</li>
	<li>Provocación nasal: Administrar 50 μL de OVA al 5% mediante gotas nasales utilizando una pipeta de 100 μL (Figura 1B) al día siguiente de la sensibilización basal, repitiendo este procedimiento durante 7 días (Figura 1C). NOTA: Prepare la solución de OVA al 5% mezclando 5 g de OVA con 100 ml de solución salina. Para el grupo control, administrar gotas del mismo volumen de solución salina.</li>
</ol>2. Puntuación conductual de ratas
<ol><li>Dentro de los 30 minutos posteriores a completar el desafío nasal final, observe y registre a las ratas con una cámara digital para identificar síntomas como rascarse la nariz, estornudar y secreción nasal, según los criterios de puntuación descritos en la Tabla 1 (Figura 1D). NOTA: La confirmación del modelado de RA exitoso se basa en lograr una puntuación total de ≥5 puntos14.</li>
</ol>3. Adquisición de muestras de mucosa nasal
<ol><li>Sacrificio de ratas: sacrificar las ratas exponiéndolas a una sobredosis de CO2. Después, desinfecte las ratas con etanol al 75% (ver Tabla de Materiales). Use un bisturí para hacer una incisión a lo largo de las dos esquinas de la boca para exponer el tejido muscular (Figura 2A). A continuación, corte las articulaciones del hueso cigomático y la mandíbula a ambos lados del cráneo con unas tijeras de tejido (Figura 2B) y retire la mandíbula (Figura 2C).</li>
	<li>Exposición de la cavidad nasal: separar la piel del maxilar con un hemostático (Figura 2D) para exponer la cavidad nasal (Figura 2E). Corte la conexión ósea entre la cavidad nasal y el maxilar con unas tijeras de tejido (Figura 2F). A continuación, cortar la conexión entre la cavidad nasal y los huesos orbitarios de ambos lados en el agujero infraorbitario (Figura 2G) y extirpar la cavidad nasal (Figura 2H).</li>
	<li>Fijación: colocar la cavidad nasal extraída en paraformaldehído al 4% para su fijación y conservarla a temperatura ambiente durante 24-72 h (ver Tabla de Materiales). NOTA: Asegúrese de que la cantidad de fijador de paraformaldehído utilizada sea suficiente para cubrir completamente las secciones para una fijación adecuada.</li>
</ol>4. Preprocesamiento de muestras de mucosa nasal
<ol><li>Descalcificación: comience fijando los tejidos eliminados del paso 3.1. Lávelos tres veces con PBS durante 20 minutos cada uno. A continuación, lávelos tres veces con agua destilada, cada vez durante 20 minutos. Posteriormente, descalcificar los tejidos en una solución de descalcificación con un volumen de 20-30 veces el de los tejidos a temperatura ambiente.<ol><li>La solución de descalcificación (ver Tabla de Materiales) debe mantener un pH de 7.2-7.4. Finalmente, coloque el tejido descalcificado en una caja de deshidratación. NOTA: La solución descalcificante debe cambiarse semanalmente. El proceso de descalcificación puede concluir cuando el tejido se ablanda (aproximadamente 2 meses).</li>
	</ol></li>
	<li>Deshidratación y encerado: transfiera la caja de deshidratación a un deshidratador (ver Tabla de Materiales). Comience con 75% de alcohol durante 4 h, seguido de 85% de alcohol durante 2 h, 90% de alcohol durante 2 h y 95% de alcohol durante 1 h.<ol><li>Posteriormente, sumerja el tejido en etanol anhidro durante 30 minutos, repita el proceso durante otros 30 minutos, use xileno durante 5-10 minutos, repita este paso durante otros 5-10 minutos, sumerja el tejido en cera durante 1 h, repita este paso durante otra hora y, finalmente, sumerja el tejido en cera durante 1 hora adicional.</li>
	</ol></li>
	<li>Incrustación: coloque el bloque de cera derretida en la caja de incrustación (consulte la tabla de materiales) y guárdelo en un congelador a -20 ° C. Una vez que la cera se solidifique, retírala y recorta el bloque de cera.</li>
	<li>Loncheado: insertar el bloque de cera recortado en un micrótomo de parafina (ver Tabla de materiales) y cortarlo en rodajas con un grosor de 3 μm. Coloque las rodajas en un baño de agua a 40 °C en un esparcidor deslizante. Aplanar el pañuelo, luego levantarlo con un portaobjetos de vidrio y hornearlo en un horno a 60 ° C.<ol><li>Una vez que el agua se haya evaporado y la cera esté bien fraguada, retire los portaobjetos y guárdelos a una temperatura de 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tinción de H&E del tejido de la mucosa nasal
<ol><li>Desparafinado e hidratación: colocar las rodajas en xileno durante 20 min, repetir el proceso durante otros 20 min, etanol absoluto durante 5 min, repetir este paso durante otros 5 min, alcohol al 75% durante 5 min, y finalmente, lavar durante 5 min.</li>
	<li>Tinción con hematoxilina: dispensar 100 μL de solución de tinción con hematoxilina (ver Tabla de materiales) durante 3-5 min con una pipeta de 100 μL, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de etanol de ácido clorhídrico al 0,5% durante 10-30 s, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de agua amoniacal al 0,2% durante 10-30 s y enjuagar durante 30 s. NOTA: Después de la tinción con hematoxilina, es necesaria la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5% para eliminar el exceso de colorante de hematoxilina unido al núcleo y absorbido por el citoplasma. Cuando se realiza la tinción con eosina, los núcleos y el citoplasma se tiñen claramente. Las rodajas aparecerán rojas o rosadas después de la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5%, así que enjuague inmediatamente después de la diferenciación para eliminar el ácido de las rodajas de tejido y detener la diferenciación. A continuación, utilice agua con amoníaco al 0,2% para mejorar la tinción nuclear.</li>
	<li>Tinción con eosina: utilice una pipeta de 100 μL para dispensar 100 μL de solución de tinción con eosina (consulte la Tabla de materiales) durante 5 min y enjuague durante 30 s.</li>
	<li>Deshidratación y sellado: sumergir las rodajas en etanol absoluto durante 5 minutos, repetir el proceso durante otros 5 minutos, repetir una vez más durante 5 minutos, dimetil durante 5 minutos y xileno durante 5 minutos. Por último, sellar con resina neutra (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Colocación de la sección teñida en el microscopio: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio hasta que la imagen sea claramente visible, ajuste el aumento a 40x y capture la imagen.</li>
</ol>6. Inmunotinción multicolor del tejido de la mucosa nasal
<ol><li>Desparafinado e hidratación: siga lo mismo que se mencionó en el paso 5.1.</li>
	<li>Tratamiento con tampón de citrato-fosfato: coloque el tampón de citrato-fosfato (pH 6,0) (consulte la tabla de materiales) en un recipiente apto para microondas. Caliéntalo hasta que hierva, retíralo y luego agrega los portaobjetos al recipiente. Cocine en el microondas a fuego medio durante 8 minutos hasta que hierva, apague el fuego durante 8 minutos y luego cambie a fuego medio-bajo durante 7 minutos.<ol><li>Después del enfriamiento natural, transfiera las rodajas a PBS (pH 7.4), agítelas y lávelas tres veces con una coctelera decolorante, cada vez durante 5 minutos. NOTA: Asegúrese de que el tampón no se evapore durante este proceso y evite que las rodajas se sequen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueo de la peroxidasa endógena: secar las rodajas, dibujar un círculo alrededor del tejido con un bolígrafo inmunohistoquímico (para evitar que el anticuerpo se desvanezca) y aplicar una solución de peróxido de hidrógeno al 3% (peróxido de hidrógeno: agua pura = 1:9).<ol><li>Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Después del enfriamiento natural, coloque las rodajas en PBS (pH 7.4) y agítelas en una coctelera decolorante durante tres ciclos de 5 minutos cada uno.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueo: aplicar un 5% de suero de cabra dentro del círculo e incubar durante 30 min.</li>
	<li>Adición primaria de anticuerpos: retire suavemente la solución de bloqueo, agregue FOXP3 (dilución: 1:200, consulte la tabla de materiales) a la rebanada y colóquela en una cámara húmeda. Incubar a 4 °C durante la noche. NOTA: Agregue una pequeña cantidad de agua a la cámara húmeda para evitar la evaporación de anticuerpos.</li>
	<li>Adición secundaria de anticuerpos: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Seque suavemente las rodajas y aplique el anticuerpo secundario (IgG H&L contra el conejo de cabra, consulte la tabla de materiales) dentro del círculo. Incubar a temperatura ambiente durante 50 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Preparación de la solución de dilución de tiramida: combinar 100 μL de H 2 O2al 3% con 100 ml de 1x TBST (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Adición de la solución de trabajo TSA: Mezcle 1 ml de diluyente de tiramida con 2 μl de CY3-tiramida para preparar la solución de trabajo de TSA. Aplicar 100 μL de solución de trabajo TSA a cada rebanada e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min. Luego, lave las rodajas con PBS tres veces, 5 minutos cada vez. NOTA: Prepare y utilice inmediatamente la solución de trabajo TSA y guárdela a 4 °C en la oscuridad; Tiene una validez de hasta 24 h.</li>
	<li>Repita los pasos 6.2-6.8: cambie a una dilución 1:200 de RORγt (colorante fluorescente FITC) y luego a una dilución 1:200 de TICAM1 (colorante TYP620) (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Núcleos contrateñidos con DAPI: agitar suavemente las rodajas para secarlas, aplicar solución de tinción DAPI e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Autofluorescencia de apagado: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Aplique el extintor de autofluorescencia (consulte la Tabla de materiales) a las rodajas, espere 5 minutos y luego lave durante 10 minutos.</li>
	<li>Bloqueo: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Agite suavemente las rodajas para secarlas y séllelas con el extintor antifluorescente (consulte la tabla de materiales).</li>
	<li>Microscopía: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para una visibilidad clara, ajuste el aumento a 20x y 40x y capture la imagen. NOTA: DAPI tiene una longitud de onda de excitación UV de 330-380 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm (luz azul). FITC tiene una longitud de onda de excitación de 465-495 nm y una longitud de onda de emisión de 515-555 nm (luz verde). CY3 tiene una longitud de onda de excitación de 510-560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm (luz roja). TYP-690 tiene una longitud de onda de excitación de 630 nm y una longitud de onda de emisión de 690 nm (luz rosa).</li>
</ol>

Inmunofluorescencia multicolor del tejido nasal en un modelo de rata con rinitis alérgica

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+and+the+regulation+of+Treg/Th17+differentiation.">Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation.</a> Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).</li><li>Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+research+advances+of+toll-like+receptors+and+allergic+rhinitis.">Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis.</a> Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).</li><li>Shan, H., Jie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+TLR4+gene+polymorphisms+and+allergic+rhinitis.">Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis.</a> Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).</li><li>Xu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+mechanism+of+Treg+cells+and+TICAM-1+patients+with+severe+allergic+rhinitis.">Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis.</a> Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).</li><li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1+CD8++T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma.">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li><li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+hpv-associated+head+and+neck+cancer.">PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li><li>Gustavson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+automated+quantitative+analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).</li><li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1/PD-L1+checkpoint+blockade:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li><li>Hernandez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+for+immune+cell+profiling+of+paraffin-embedded+tumor+tissues.">Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria no infecciosa de la mucosa nasal que resulta de una combinación de factores ambientales y genéticos. Se ha convertido en un problema de salud mundial, que afecta la eficiencia del trabajo, disminuye la calidad de vida, perjudica el sueño, la función cognitiva y causa irritabilidad y fatiga. La RA afecta a entre el 10 % y el 20 % de la población mundial¹ y conlleva costes económicos sustanciales, causando pérdidas anuales de hasta 30-50 mil millones de euros...

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica1,2. Se caracteriza por síntomas como estornudos, secreción nasal, congestión nasal y picazón nasal. Con la industrialización y la urbanización, la prevalencia de la RA está aumentando gradualmente, afectando aproximadamente al 10%-20% de la población mundial1. La técnica de inmunofluorescencia (IF) es un método de tinción fluorescente que utiliza una reacción de unión anticuerpo-antígeno. Se puede emplear para detectar y cuantificar los niveles de distribución y expresión de proteínas específicas en tejidos biológicos o células. En la investigación de RA, la FI puede detectar simultáneamente múltiples dianas, incluidas citoquinas relacionadas con la RA, células inflamatorias, receptores y más, lo que facilita la exploración de la patogénesis de la RA y los efectos de los fármacos 3,4,5,6.
El proceso de tinción por inmunofluorescencia multicolor (mIF) se parece mucho al FI tradicional, con la adición de un paso de elución de anticuerpos durante cada ronda de tinción. Esta modificación permite la detección simultánea de múltiples biomarcadores en la misma sección de tejido a través de un solo etiquetado secuencial y múltiples rondas de retinción. La mIF se basa en la amplificación de la señal de tiramida (TSA), lo que permite ciclos repetidos de tinción fluorescente de TSA y el uso de calentamiento por microondas para eliminar los anticuerpos mientras se conservan las señales fluorescentes 7,8. En comparación con el FI convencional, el FIm ofrece varias ventajas: (1) puede detectar antígenos débilmente expresados que son difíciles de identificar con el FI convencional 9,10; (2) proporciona una tinción de alta calidad con una relación señal-ruido mejorada; (3) permite cuantificar las estructuras específicas de los tejidos y las regiones de interés11; (4) la multiplexación de múltiples vías utiliza eficientemente los tejidos y conserva los recursos patológicos limitados12; (5) el análisis multiparamétrico a través de mIF ofrece una visión más profunda de los tejidos, descubriendo información biológica oculta13.
En general, mIF permite la observación de diferentes expresiones y distribuciones de antígenos dentro de una misma muestra, facilitando el estudio de las proteínas diana. En el futuro, los investigadores que busquen comprender la expresión y distribución de múltiples proteínas diana encontrarán en esta técnica una opción valiosa. Este estudio demuestra la aplicación de mIF para la tinción de muestras de mucosa nasal de ratas con RA y evalúa el establecimiento de un modelo de RA en ratas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Al(OH)3</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A7130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Anhui Yiren An Co., Ltd</td>
			<td>20210107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021070101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescence quenching sealer</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic dyeing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Varistain Gemini ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier slides</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-phosphate buffer&#160;</td>
			<td>Servicebio biotechnology co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid antigen repair solution (PH 6.0)</td>
			<td>Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>CS01-2450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1223-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decoloring shaker</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>S1010E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA decalcification solution</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CR2203047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating blast dryer&#160;</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding box marking machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>&#160;PrintMate AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast tissue dewatering machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>STP420 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film sealer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Autostainer 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Tyramide</td>
			<td>Sawell Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>G1222-50UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Sunny Optical Technology Co.Ltd</td>
			<td>CX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxp3</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>bs-10211R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing table</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Liankebio Co., Ltd</td>
			<td>GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DH0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td>
			<td>210608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemical pen</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BC004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Midea</td>
			<td>M1-L213B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral gum</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A804010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palm centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>D1008E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>P0099-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathology section scanner</td>
			<td>3DHISTECH Kft</td>
			<td>Pannoramic SCAN&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette&#160;</td>
			<td>Dragon</td>
			<td>KE0003087/KA0056573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ror&#947;t</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF3196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td>
			<td>20170022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B</td>
			<td>Bioengineering Co., Ltd</td>
			<td>A602008-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd</td>
			<td>PC2-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley rats</td>
			<td>Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine</td>
			<td>SYX <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65937/65937eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 2023-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TICAM-1</td>
			<td>Affinity Biosciences Co., Ltd</td>
			<td>DF6289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Shanghai Medical Devices Co., Ltd</td>
			<td>J22120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue spreading baking sheet machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYR-690 fluorescent dyes</td>
			<td>Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RC0086-34RM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>SLK-O3000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath-slide drier</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax trimmer</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JXL-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022051901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent labeling in nasal mucosa tissue sections of allergic rhinitis rats via multicolor immunoassay

La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal, mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica, que afecta aproximadamente al 10%-20% de la población mundial. Si bien la tinción por inmunofluorescencia (FI) ha sido durante mucho tiempo una técnica estándar para detectar la expresión de proteínas específicas de la enfermedad, las técnicas convencionales de FI tienen una capacidad limitada para detectar los niveles de expresión de tres o más proteínas en la misma muestra. En consecuencia, en los últimos años se han desarrollado técnicas de FI multicolor, que permiten el marcaje simultáneo de múltiples dianas en células o tejidos.
Este protocolo proporciona una visión general completa del proceso para establecer un modelo de RA en ratas, obtener muestras de mucosa nasal y los procedimientos técnicos para la inmunofluorescencia multicolor. Todas las ratas en el grupo de RA exhibieron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal, con observaciones de comportamiento que obtuvieron ≥5 puntos. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló un aumento de los recuentos de células inflamatorias y una alteración de la integridad de la mucosa nasal en el grupo AR. La inmunofluorescencia multicolor (mIF) demostró un aumento de la expresión de RORγt y TICAM-1, mientras que la expresión de Foxp3 disminuyó en el tejido de la mucosa nasal de ratas AR.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE)1,2. It is characterized by symptoms such as sneezing, a runny nose, nasal congestion, and nasal itching. With industrialization and urbanization, the prevalence of AR is gradually increasing, affecting approximately 10%-20% of the world&#39;s population1. The immunofluorescence (IF) technique is a fluorescent staining method that utilizes an antibody-antigen binding reaction. It can be employed to detect and quantify the distribution and expression levels of specific proteins in biological tissues or cells. In AR research, IF can simultaneously detect multiple targets, including AR-related cytokines, inflammatory cells, receptors, and more, facilitating the exploration of AR pathogenesis and the effects of drugs3,4,5,6.
The multicolor immunofluorescence (mIF) staining process closely resembles traditional IF, with the addition of an antibody elution step during each round of staining. This modification enables the simultaneous detection of multiple biomarkers on the same tissue section through sequential single-labeling and multiple rounds of re-staining. mIF is based on tyramide signal amplification (TSA), allowing for repeated cycles of TSA fluorescent staining and the use of microwave heating to remove antibodies while retaining fluorescent signals7,8. In comparison to conventional IF, mIF offers several advantages: (1) it can detect weakly expressed antigens that are challenging to identify with conventional IF9,10; (2) it provides high-quality staining with an improved signal-to-noise ratio; (3) it allows for the quantification of tissue-specific structures and regions of interest11; (4) multiplexing multiple pathways efficiently utilizes tissues and conserves limited pathological resources12; (5) multi-parameter analysis through mIF offers deeper insights into tissues, uncovering hidden biological information13.
Overall, mIF allows the observation of different antigen expressions and distributions within the same sample, facilitating the study of target proteins. In the future, researchers seeking to understand the expression and distribution of multiple target proteins will find this technique a valuable choice. This study demonstrates the application of mIF for staining nasal mucosa samples from rats with AR and evaluate the establishment of a rat model of AR.

Autor destacado: Avance en la investigación de la rinitis alérgica con inmunofluorescencia multicolor

Marcaje inmunofluorescente en secciones de tejido de la mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica mediante inmunoensayo multicolor

Our main research is based on a study of allergic rhinitis. Our research intends to analyze what proteins are associated with allergic rhinitis. Multicolor immunofluorescence is currently used to advance research in our field.In future studies, we will focus on the possible mechanisms of TCM in the treatment of allergic rhinitis.

Seis ratas SD fueron inducidas con éxito en el modelo AR mediante inyección intraperitoneal de OVA y provocación nasal. La RA fue inducida en todas las ratas del grupo AR, lo que representa el 100% del grupo. Todas las ratas del grupo AR mostraron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal. Todas las observaciones conductuales obtuvieron una puntuación de ≥5 puntos (Tabla 2).
Los resultados de la tinción de H&E enel día 21 del mode...

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Este protocolo describe una técnica de inmunofluorescencia multicolor para evaluar el modelo de rinitis alérgica en ratas.

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), ...

Nuestra investigación principal se basa en un estudio de rinitis alérgica. Nuestra investigación pretende analizar qué proteínas se asocian con la rinitis alérgica. La inmunofluorescencia multicolor se utiliza actualmente para avanzar en la investigación en nuestro campo.En futuros estudios, nos centraremos en los posibles mecanismos de la MTC en el tratamiento de la rinitis alérgica.

immunofluorescent-labeling-nasal-mucosa-tissue-sections-allergic

Research

JoVE Journal

Medicine

Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay

1.1K vistas.  Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. Nuestra investigación principal se basa en un estudio de rinitis alérgica. Nuestra investigación pretende analizar qué proteínas se asocian con la rinitis alérgica. La inmunofluorescencia multicolor se utiliza actualmente para avanzar en la investigación en nuestro campo.En futuros estudios, nos centraremos en los posibles mecanismos de la MTC en el tratamiento de la rinitis alérgica.

Video: Autor destacado: Avance en la investigación de la rinitis alérgica con inmunofluorescencia multicolor

Allergic rhinitis (AR) is a chronic, non-infectious inflammatory disease of the nasal mucosa, primarily mediated by specific immunoglobulin E (IgE), affecting approximately 10%-20% of the world's population. While immunofluorescence (IF) staining has long been a standard technique for detecting disease-specific protein expression, conventional IF techniques are limited in their ability to detect the expression levels of three or more proteins in the same sample. Consequently, multicolor IF techniques have been developed in recent years, which allow the simultaneous labeling of multiple targets in cells or tissues.
This protocol provides a comprehensive overview of the process for establishing a rat model of AR, obtaining nasal mucosal samples, and the technical procedures for multicolor immunofluorescence. All rats in the AR group exhibited typical symptoms such as sneezing, a runny nose, and an itchy nose, with behavioral observations scoring &#8805;5 points. Hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining revealed increased inflammatory cell counts and disrupted nasal mucosal integrity in the AR group. Multicolor immunofluorescence (mIF) demonstrated increased expression of ROR&#947;t and TICAM-1, while Foxp3 expression decreased in the nasal mucosa tissue of AR rats.

This protocol describes a multicolor immunofluorescence technique for evaluating the rat model of allergic rhinitis.

Investigación

Medicina

Acquisition and Pre-Processing of Nasal Mucosal Samples from Rats with Allergic Rhinitis

To begin, with a scalpel, make a precise incision along the two corners of the mouth of a euthanized rat to expose the muscle tissue. Use a pair of tissue scissors to cut the joints of the zygomatic bone and the mandible on both sides of the skull. Then remove the mandible.Use tissue scissors to cut the bony connection between the nasal cavity and the maxilla. Then use a hemostat to separate the skin of the maxilla to expose the nasal cavity. Sever the connection between the nasal cavity and the orbital bones on both sides at the infraorbital foramen, and remove the nasal cavity.Place the extracted nasal cavity in a 4%Paraformaldehyde solution for fixation. To decalcify the tissue, wash the fixed tissue with distilled water. Place the tissues in a decalcification solution with a volume 20 to 30 times that of the tissues at room temperature.Once decalcification is complete, place the tissue in a dehydration box. Transfer the dehydration box to a dehydrator and dehydrate the tissue in increasing alcohol concentrations at different incubation times. Next, place the tissue in anhydrous ethanol for 30 minutes for two cycles.Following this, transfer the tissue to xylene for five to 10 minutes and repeat, then immerse the tissue in wax for one hour. Place the wax block in embedding cassettes. Remove the wax blocks after they have solidified and trim the wax block.Insert the trimmed wax block into a paraffin microtome and cut it into three micrometer thick slices. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.

Adquisición y preprocesamiento de muestras de mucosa nasal de ratas con rinitis alérgica

Multicolor Immunostaining of Nasal Mucosal Tissues of Rats with Allergic Rhinitis

To begin, place the hematoxylin and eosin stained rat nasal mucosal tissue sections onto a microscope stage. Adjust the microscope's focus until the image is clearly visible. Capture the tissue image at 40X.Heat the citrate phosphate buffer until it boils. Then add the slides to the container after removing it from the heat. After heating for eight minutes until boiling, turn off the heat for eight minutes and subsequently switch to medium low heat for seven minutes.After allowing the container to cool naturally transfer the slices to PBS. Use a decolorizing shaker to shake the slices for five minutes. Next draw a circle around the dried tissue with an immunohistochemical pen.Add 3%hydrogen peroxide solution to the slices before incubating. Then transfer the slices to PBS for washing as before. To block, apply 5%goat serum within the marked circle.After incubation, carefully remove the blocking solution and add one to two milliliters of FOXP3 to the tissue slices. Then place the slices in a humid chamber for overnight incubation. After washing the slices in PBS, gently dab the slices dry with filter paper.Then add one to two milliliters of the secondary antibody solution to the slices. Next incubate the slices in 100 microliters of tyramide signal amplification working solution for 10 minutes at room temperature in the dark. After incubation, wash the slices with PBS three times for five minutes each.Now apply one to two milliliters of DAPI staining solution to the slices before incubation. Quench the auto fluorescence by incubating the slices in the quencher for five minutes before a 10 minute PBS wash. Then seal them with the anti fluorescence quencher.Capture the microscopic images of the stained sections under 20X and 40X magnification. Hematoxylin and eosin staining of the control rats showed well arranged epithelial cells and cilia. The nasal septum mucosa was damaged and detached in the disease group with notable neutrophil infiltration.Multi immunofluorescent staining revealed that the expressions of ROR Gamma T and TCAM1 were increased in the disease group. However, FOXP3 was under expressed.