Realice el aislamiento de células de nicho limbal, o LNC, mientras trabaja en condiciones estériles en un banco de trabajo ultralimpio. Recupere el tejido del limbo del medio de almacenamiento corneal a término intermedio. Con una cuchilla redonda quirúrgica estéril, raspe y retire el iris y el endotelio alrededor de la córnea.
A continuación, con la cuchilla redonda quirúrgica estéril, corte el tejido del limbo en 12 trozos iguales, dejando solo un milímetro de tejido a ambos lados de la córnea y la esclerótica. Después de eso, transfiera las 12 piezas de tejido del limbo a una placa de cultivo de 35 milímetros y agregue 1 mililitro de colagenasa A para sumergir completamente los tejidos en la placa. Digiera los tejidos incubando la placa de cultivo en una incubadora de células a 37 grados centígrados durante 18 horas.
Descongelar la matriz de matrigel o membrana basal en un refrigerador a 4 grados centígrados. Prepare una bolsa esterilizada que contenga puntas de 200 microlitros y 1 mililitro, un tubo de centrífuga de 15 mililitros y una placa de 6 pocillos, y coloque la bolsa a menos 20 o menos 80 grados centígrados durante 20 minutos. Después de recuperar las puntas, el tubo de centrífuga y la placa de 6 pocillos del enfriador, proceda a realizar los siguientes pasos en un banco de trabajo ultralimpio.
Con una punta preenfriada de 200 microlitros, pipetee 50 microlitros de la matriz de membrana basal descongelada en 1 mililitro de MESCM y mézclelo suavemente. Utilizando una punta de 1 mililitro preenfriada y colocada en una pipeta, transfiera la matriz de membrana basal resultante al 5 % a un solo pocillo de la placa de cultivo de 6 pocillos preenfriada. Agite suavemente la placa de 6 pocillos horizontalmente antes de colocarla en una incubadora a 37 grados centígrados durante aproximadamente una hora para preparar la placa de cultivo recubierta de matrigel al 5%.
Después de la digestión de 18 horas, recupere la colagenasa A digerida del tejido limbal, que en su mayoría contiene pequeños grupos visibles. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para separar los grupos de los tejidos esclerales no digeridos. Sumerja los racimos separados en tripsina-EDTA al 0,25% en una placa de cultivo de 35 milímetros e incube la placa durante 15 minutos.
A continuación, añade 1 mililitro de MESCM con un 10% de suero knockout a la placa para saciar la digestión celular. Pipetee suavemente la suspensión hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1 mililitro para dividir los grupos en células individuales. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifugue a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Sin alterar el gránulo de la célula, retire con cuidado el sobrenadante y agregue 1 mililitro de MESCM para resuspender las células. Con una punta de pipeta de 1 mililitro, pipetee el contenido hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces para asegurarse de que todo el gránulo se resuspenda en MESCM. Recoja 20 microlitros de la suspensión para el recuento de células.
A continuación, con una pipeta de 1 mililitro, transfiera la suspensión celular a la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal al 5%. Agregue MESCM para que el volumen total en el pozo sea de 2,5 mililitros. Agite suavemente la placa de 6 pocillos horizontalmente para asegurar una distribución uniforme de las células.
Después de obtener imágenes de las células, transfiéralas a una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados. El protocolo demostrado digirió con éxito el tejido del borde escleral de la córnea, generando grupos que pudieron visualizarse bajo el microscopio. Como era de esperar, los racimos se asemejaban a la forma de una oruga.
Los LNC primarios crecieron lentamente y requirieron aproximadamente 12 días para el cultivo. Los LNC del pasaje 1 al pasaje 8 necesitaron alrededor de tres días para su aprobación, pero la tasa de crecimiento de los LNC después del pasaje 9 disminuyó significativamente. Morfológicamente, los LNC tenían forma de huso y eran redondos en el pasaje 0.
Después del paso 3, se les dio forma de huso con tamaños uniformes. El número de duplicaciones celulares o NCD representó la tasa de crecimiento de las LNC. Las curvas de NCD y NCD acumulativas revelaron que los LNC crecieron más rápido desde el pasaje 3 hasta el pasaje 5.
