Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis

Para comenzar, perfunde la solución externa con solución salina oxigenada durante cinco minutos. Con una pipeta, transfiera 10 microlitros de la solución de disección a una placa de Petri. Ahora, use agujas de jeringa y un microscopio para diseccionar cuidadosamente los cerebros de las moscas anestesiadas de tipo salvaje establecido y noqueadas.

Con una pipeta, transfiera el cerebro preparado a una placa de registro con cinco mililitros de solución externa. Inmoviliza los cerebros con un soporte de Do sostenido. A continuación, captura la imagen confocal de cada cerebro a 20x.

Utilice el modo de escaneo XYT e identifique las neuronas del cuerpo del hongo con una amplificación digital adicional de 4,5 veces. Ajuste la excitación del láser a 488 nanómetros con una potencia láser de 16 microvatios para adquirir la emisión GCaMP6m de todo el cerebro. A continuación, ajuste los parámetros de escaneo a una velocidad de 1400 con un tamaño de píxel de 256 por 256 píxeles.

Ajuste la velocidad de adquisición a 5,3 hercios y grabe durante tres minutos. Analizar la fluorescencia de cinco a ocho regiones de interés. Determine manualmente el cuerpo celular de las neuronas del cuerpo del hongo como la región de interés.

Utilice la imagen J para etiquetar las neuronas identificadas y medir sus intensidades de fluorescencia. Analice los datos de fluorescencia de GCaMP6m como se muestra. Defina la fluorescencia intracelular que aumenta entre dos y 2,5 desviaciones estándar como picos pequeños y los que aumentan más de 2,5 desviaciones estándar como picos grandes.

Se observaron señales de calcio en el cuerpo de las moscas en forma de hongo. Las moscas de derribo de cac mostraron más picos grandes que pequeños.