Después de cocultivar jurkats que expresan CAR con células tumorales marcadas con CFSE, invierta suavemente la placa sobre una toalla de papel y golpee para desechar los sobrenadantes que contienen CAR-J. Con una pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de medios FluoroBrite DMEM que contengan yodo propidio, o PI, en los pocillos sin alterar las células tumorales adheridas. A continuación, agregue 20 microlitros de Triton X al 20% al primer pocillo de cada tipo de tumor, sirviendo como un control muerto total.
Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 20 minutos antes de la obtención de imágenes. Después de la obtención de imágenes fluorescentes, use uno de los pocillos de células solo para tumores para calibrar el canal fluorescente verde. Para excluir las células en el borde de los pocillos, disminuya la máscara del pocillo al 98 %Identifique las células tumorales marcadas con CFSE en el canal fluorescente verde y ajuste el valor del umbral de intensidad de fluorescencia para capturar todas las células del pocillo.
Establezca el diámetro mínimo de la celda en 25 micrómetros para excluir los residuos detectados en el canal CFSE. A continuación, habilite los objetos táctiles separados para identificar celdas individuales. A continuación, establezca puertas para definir las poblaciones de células vivas frente a las muertas.
Seleccione las celdas marcadas con CFSE y genere un histograma de recuentos en el eje Y frente a la intensidad media de PI en el eje X. Ajuste el valor del eje x para visualizar mejor las celdas y dibuje un divisor para diferenciar entre las células teñidas con PI bajo y las células teñidas con PI alto. Etiquete las células teñidas con PI bajo como células vivas.
A continuación, establezca otro histograma en celdas vivas con el área en el eje x y los recuentos en el eje y. Etiquete las células que no son residuos como células vivas grandes. A continuación, dibuja otro divisor utilizando el tumor solo bien para capturar las células y filtrar los desechos.
Después de ejecutar el análisis en toda la placa, exporte la hoja de cálculo que contiene los números. Grafique los recuentos de células grandes para determinar la cantidad de células tumorales vivas marcadas con CFSE que permanecen en el pocillo después de la exposición al CAR-J. Por último, realice un análisis estadístico utilizando ANOVA de un factor.
La citotoxicidad de CAR-J1 aumentó con una mayor proporción efectora/tumor y se observó más del 50% de muerte con una relación efector/tumoral de cuatro a uno. Las construcciones de CAR dirigidas a EGFR con dominios de bisagra modificados mostraron una muerte específica del antígeno contra las células MDA-MB-231 que expresan EGFR, y no se observó una muerte significativa contra las células knockout de EGFR. Las construcciones de CAR también se expresaron en células T CD3 derivadas de PBMC.
Sin embargo, no hubo expresión de EGFR-CAR que contuviera bisagras CD8. La IgG corta mostró la menor potencia citotóxica frente a las células MDA-MB-231 en comparación con la IgG larga y la IgG media.
