Para comenzar, extirpe la médula espinal de un ratón decapitado que haya sido perfundido con PBS. Sumerja la médula espinal en DPBS frío en una placa de Petri con hielo. Con una aguja de calibre 18 y una jeringa de 10 mililitros llena de DPBS frío, utilice la extrusión hidráulica para aislar toda la médula espinal en una campana de flujo laminar.
Transfiera la médula espinal a la placa de Petri con DPBS frío colocado en compresas de hielo. Con un microscopio dentro de la campana de flujo laminar, retire cuidadosamente las meninges visibles con pinzas afiladas. Luego, transfiera la médula espinal a una placa de Petri vacía y use una hoja de bisturí quirúrgico No.10 para cortarla en secciones de dos a tres milímetros de largo.
Para la disociación enzimática de las células espinales, agregue las mezclas enzimáticas 1 y 2 a las piezas de la médula espinal. Agite las enzimas en el plato varias veces para asegurar un recubrimiento uniforme de la médula espinal. Incubar el plato a 37 grados centígrados durante 30 minutos, agitando manualmente el plato cada 10 minutos.
Después de la incubación, agregue 350 microlitros de DNAse I. Gire el plato suavemente para mezclar. A continuación, agregue un mililitro de DMEM frío complementado con 0.5% FBS antes de mezclar suavemente. Transfiera inmediatamente todo el contenido a un tubo de cinco mililitros.
Con una pipeta P1000, triture suavemente el tejido tres veces. Luego, use una pipeta Pasteur de vidrio de nueve pulgadas tapada para triturar suavemente el tejido cinco veces más. Coloque el tubo en posición vertical durante 30 segundos para permitir que el tejido se asiente.
Con una pipeta P1000, aspire el sobrenadante y transfiéralo a través de un filtro de 30 micrómetros a un tubo cónico de 15 mililitros. Al tubo con los tejidos restantes, agregue un mililitro de DMEM suplementado con FBS. A continuación, triture suavemente tres veces con una pipeta Pasteur.
Después de dejar que el tejido se asiente en el fondo, pase el sobrenadante a través de un filtro de 30 micrómetros y recójalo en el mismo tubo de 15 mililitros utilizado anteriormente. Centrifugar la suspensión celular filtrada a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Use un aspirador de vacío para desechar cuidadosamente el sobrenadante.
Use la solución de eliminación de desechos provista en el kit de disociación cerebral para adultos para eliminar la mielina del gránulo celular. Luego, agregue cinco mililitros de DMEM suplementado con FBS al gránulo e invierta suavemente el tubo tres veces para mezclar. Después de centrifugar, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de DPBS suplementado con FBS.
Centrifugar de nuevo antes de desechar el sobrenadante. Etiquetó las células con MicroBeads Anti-ACSA-2 siguiendo el protocolo del fabricante. Utilice las columnas de separación magnética para separar las celdas mediante selección positiva.
A continuación, centrifugar las células a 300 g durante 10 minutos antes de desechar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el gránulo celular en un mililitro de DMEM tibio suplementado con FBS. Transfiera la suspensión celular a un hemocitómetro para contar las células y evaluar su viabilidad.
Ajuste la concentración de células a 75.000 células por cada 50 microlitros con FBS DMEM. Luego, transfiera 50 microlitros de la suspensión celular a un cubreobjetos recubierto de poli-L-lisina en una placa de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos horas para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos.
Luego, agregue con cuidado 450 microlitros de FBS DMEM tibio y suplementado con antibióticos a cada pocillo. Se observó un aislamiento y proliferación exitosos de microglía y astrocitos. Al cuarto día, se observó que los astrocitos formaban procesos más largos, mientras que se observaron células microgliales ovaladas con husos más cortos.
Los astrocitos formaron una capa confluente conectada al séptimo día, y la microglía mostró menos procesos y más cortos. La clasificación celular confirmó una viabilidad celular del 92 al 93% del cultivo celular aislado.
