Preservación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas con criopreservación optimizada

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November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200824-v

November 3rd, 2023

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Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* Estos autores han contribuido por igual

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Para empezar, disocie las células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de hESC, prepare la suspensión celular y luego cuente las células. Ahora, centrifuga las células a 250 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Vierta el sobrenadante, luego, vuelva a suspender la célula en un medio de criopreservación.

A continuación, transfiera un mililitro de la suspensión celular a un vial criogénico de 1,2 mililitros. Coloque los viales criogénicos en un recipiente de congelación y congele durante la noche a menos 80 grados centígrados. Transfiera los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Para descongelar los viales congelados, primero caliente el medio de cultivo en perlas metálicas calentadas a 37 grados centígrados, llene previamente 10 mililitros del medio de cultivo calentado en un tubo de 15 mililitros. Ahora, retire los viales criogénicos del nitrógeno líquido y colóquelos en un sistema de descongelación automatizado para una descongelación rápida. Deje caer de 0,5 a un mililitro del medio de cultivo precalentado en el vial criogénico para garantizar una adaptación gradual de las células.

A continuación, pipetee de 1,5 a dos mililitros de la suspensión de la célula en el tubo de 15 mililitros con medio. Centrifugar las células a 250 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Luego, desecha el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio tibio. Cargue las células en un hemocitómetro y cuéntelas para determinar las tasas de recuperación y supervivencia. Cultive las células descongeladas en placas recubiertas de membrana basal en un medio de cultivo con Y27632.

Las células epiteliales pigmentarias de la retina que se congelaron en el quinto día en su fase exponencial mostraron una mayor tasa de adhesión después de la descongelación. En relación con su morfología hexagonal característica, las células congeladas en otros puntos de tiempo tenían un fenotipo fibroblástico. Las células P2 del quinto día mostraron una mayor expresión y marcadores celulares más correctamente localizados 28 días después de la descongelación.

Se observó que los diferentes medios de criopreservación se comportaron igual de bien para lograr una alta viabilidad celular y una alta adhesión después de la descongelación.

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