עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81970816) למיי ג'יאנג; הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82201223) לשין-יואה ג'ו; ותוכנית הפעולה לחדשנות במדע וטכנולוגיה של ועדת המדע והטכנולוגיה של שנחאי (2014090067000) להאי-יון ליו.

1. דיסוציאציה של תאים
<ol><li>שמור על תאי RPE כפי שתואר קודם לכן17,22. הערה: כל התאים גדלים בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO2 לאורך כל תקופת הפרוטוקולים.</li>
	<li>הכינו את הכמות הנדרשת של PBS ומדיום תרבית באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והניחו את מגיב הדיסוציאציה של התא בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השליכו את תמיסת התרבית ושטפו את הצלחות פעמיים עם 1 מ"ל PBS שחומם מראש לכל באר.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא לצלחות 6-well ולעכל את התאים ב 37 ° C במשך 15 דקות. לאחר הדגירה, להתבונן בתאים להתכווץ ולהאיר בקצוות תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את סיום העיכול. הערה: דיסוציאציה מבוססת טריפסין אינה מומלצת מכיוון שהיא מעניקה כדאיות תאים נמוכה.</li>
	<li>פיפטה למעלה ולמטה בעדינות 10x עם פיפטה 1 מ"ל כדי לנתק את התאים, ולדלל את תרחיף התא עם מדיום תרבית שחומם מראש (ללא Y-27632) ביחס של 1:10. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות ב 250 × גרם.</li>
	<li>לשפוך במהירות את supernatant לאחר צנטריפוגה, בעדינות resuspend את גלולת התא ב 2 מ"ל של מדיום התרבית, ו resuspend את התאים 10-15x עם פיפטה.</li>
	<li>סנן את תרחיף התא עם מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לקבל תרחיף של תא בודד וחשב את מספר התאים. הערה: תרחיף חד-תאי חיוני לספירת תאים מדויקת ולצפיפות זריעת תאים אחידה לאחר ההפשרה.</li>
</ol>2. קביעת שלב התא האופטימלי לשימור בהקפאה
הערה: מאחר שמצב התא משתנה בין שיטות התמיינות לבין קווי תאים, יש לקבוע את השלב המעריכי של תאי RPE בתרבית במעבדות שונות לפני ההקפאה.
<ol><li>הפשירו בקבוקון אחד של תמיסת מטריצת קרום מרתף על קרח בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. לדלל את המטריצה לתוך 12 מ"ל של DMEM קר / F-12 ולערבב היטב. מוסיפים כיסוי אחד לכל באר, ומצפים כל באר של צלחת 24 בארות עם 0.25 מ"ל של תמיסה מדוללת. דוגרים על הצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-4°C לפני השימוש ושאפו את תמיסת הציפוי ממש לפני ציפוי התאים. הערה: ההוראות לנפח aliquot הן ספציפיות ללוט בהתבסס על ריכוז החלבון ונמצאות בגיליון מפרט המוצר.</li>
	<li>זרעו את התאים הבודדים RPE משלב 1.7 על כיסויי המטריצה המצופים בממברנת המרתף בצפיפות של 105/cm2 ב 1 מ"ל של מדיום תרבית. רעננו את מדיום התרבות כל 2-3 ימים.</li>
	<li>בנקודות הזמן שצוינו (1, 3, 5, 7 ו-11 ימים לאחר המעבר), דגרו תאי RPE עם 10 מיקרומטר EdU בתווך למשך 24 שעות. תקן, חלחל והכתים את התאים עם קוקטייל התגובה כמתואר במדריך כדי לזהות EdU משולב.</li>
	<li>צלם תמונות מחמישה שדות אקראיים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וחשב את אחוז התאים החיוביים ל- EdU. התווה את עקומות זמן הפרופורציה החיוביות המתאימות של EdU כדי ליצור עקומת צמיחה. לאחר מכן, קבע את חלון ההקפאה או את הפאזה המעריכית עבור כל קו תא בהתאם לעקומת הצמיחה. הערה: מורפולוגיית תאים משושים שהוקמה מחדש מציינת שתאים יוצאים מהשלב המעריכי.</li>
</ol>3. שימור בהקפאה
<ol><li>לאחר שלבים 1.1 עד 1.7, פרט לכך שזמן העיכול פוחת ל -5 דקות, צנטריפוגו את תרחיף התא בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות ב 250 × גרם.</li>
	<li>יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי מזיגה מהירה לאחר הצנטריפוגה ולהשהות בעדינות את כדורית התא בתווך ההקפאה לצפיפות של 2 × 106 תאים/מ"ל ולהעביר 1 מ"ל מתרחיף התא לבקבוקונים קריוגניים של 1.2 מ"ל.</li>
	<li>הניחו מיד את הבקבוקונים הקריוגניים במיכל הקפאה, הקפיאו בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה כדי להשיג קצב קירור של -1°C/min, ולאחר מכן העבירו את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>4. הפשרה
<ol><li>חממו את מדיום התרבית באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ומלאו מראש 10 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש לתוך צינור של 15 מ"ל.</li>
	<li>הפשיר במהירות את הבקבוקונים הקריוגניים שנלקחו ישירות מאחסון החנקן הנוזלי באמצעות מערכת הפשרה אוטומטית.</li>
	<li>טפטפו 0.5-1 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש לתוך הבקבוקון הקריוגני כדי להבטיח שהתאים הקפואים יסתגלו בהדרגה לסביבה החדשה. לאחר מכן, להעביר 1.5-2 מ"ל של תרחיף התא ל 10 מ"ל של מדיום התרבית בצינור 15 מ"ל צנטריפוגה את התאים ב 250 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי מזיגה מהירה לאחר הצנטריפוגה, להשהות מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש, ולספור את מספר התאים המשתמשים בהמוציטומטר כדי לקבוע את שיעורי ההתאוששות וההישרדות באמצעות הרחקה סטנדרטית של טריפאן כחול (0.4% כתם כחול טריפאן).</li>
	<li>תרבית את התאים על משטחים מצופים מטריצה של קרום מרתף בצפיפות של 105 תאים ברי קיימא לסמ"ר2 בתווך תרבית בתוספת Y-27632 (ריכוז סופי: 10 מיקרומטר). הסר Y-27632 לאחר 24 שעות.</li>
	<li>כדי לקבוע את קצב ההתקשרות, נתק שוב את התאים וספור את מספר התאים 24 שעות לאחר ההפשרה.</li>
</ol>5. אימות שלב ההקפאה האופטימלי
<ol><li>כדי לאמת את שלב ההקפאה האופטימלי שנקבע בשלב 2.4, הפשירו תאי RPE שהוקפאו בנקודות זמן שונות ובתרבית שונות למשך 28 יום. קצור את התאים עבור ניתוח qPCR ו immunostaining כדי להעריך את הביטוי של סמני RPE כפי שתואר קודם17.</li>
</ol>

קידום אחסון קריואחסון של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע אנושיים

<ol>
	<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease.">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li><li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium:+Development,+injury+responses,+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems.">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).</li><li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+cell+transplantation,+biomaterials,+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration.">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li><li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation.">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li><li>Da Cruz, ., L, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Li, Q. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases.">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305 (2021).</li><li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing.">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li><li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties.">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li><li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems:+an+opinion+paper.">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731 (2022).</li><li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+(Neuro-2a)+cells.">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells.">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431 (2019).</li><li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286 (2021).</li><li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off+the+shelf+cellular+therapeutics:+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use.">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 454 (2022).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium:+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods.">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+(RPE)+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+(hiPSC).">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells.">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274 (2017).</li><li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation:+a+focus+on+melatonin.">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254 (2022).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

במחקר הנוכחי מתואר פרוטוקול הקפאה-הפשרה מוצלח עבור תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (תאי גזע עובריים) לצורך מחקר וצרכים קליניים. שלא כמו קו תאי RPE אימורטלי, ARPE-19, תאי RPE עם פנוטיפ אפיתל אופייני תקין ותפקוד, כמו תאי תאי גזע נגזרים RPE, רגישים יותר להקפאה. פחות מ-32% מהתאים נשארו 24 שעות לאחר הה...

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבה פיגמנטית של תאים הדרושה לשמירה על תפקוד תקין של הרשתית1. תפקוד לקוי ומוות של RPE קשורים קשר הדוק למחלות ניווניות רבות ברשתית, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטיניטיס פיגמנטוזה ומחלת סטארגרדט 2,3. טיפול חלופי RPE הוא אחד משטרי הטיפול המבטיחים ביותר עבור מחלות אלה 4,5,6,7. אספקה יציבה של תאי RPE מתורם חיונית לטיפול תאי. תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מקור תאי אידיאלי לטיפול תאי מכיוון שהם מחקים את תפקודם של תאי RPE ראשוניים ויכולים לייצר אספקה בלתי מוגבלת תיאורטית8. עם זאת, תהליך ההתמיינות מייגע וחיי המדף של תאי RPE המתקבלים קצרים יחסית בגלל מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) לאחר מכן. לכן, שימור בהקפאה של תאי RPE שמקורם בתאי תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) הוא צעד הכרחי הנדרש לאחסון לטווח ארוך ולהפצה לפי דרישה9.
נזק תאי הנגרם על ידי שימור בהקפאה עלול לפגוע בשוגג ביעילות הטיפולית10,11. לכן, מחקרים אחרונים על שימור קריוגני הציעו כי יש לקבוע תנאי אחסון קריוגניים אופטימליים בעת תכנון טיפולים תאיים12. שימור קריוגני מוצלח מבטיח התאוששות תאים יעילה, כדאיות גבוהה ושיקום תפקוד התא לאחר מחזור ההקפאה-הפשרה. עם זאת, מחקרים קודמים על שימור בהקפאה של חד-שכבות דבקות של תאי יונקים דיווחו על שיעורי הישרדות משתנים מאוד (35%-95%) לאחר הפשרהשל 13,14,15. גורמים רבים משפיעים במידה ניכרת על תוצאות השימור בהקפאה, במיוחד בשלב ההקפאה 16,17. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי תאי RPE שהוקפאו בנקודות זמן שונות הציגו התאוששות מגוונת לאחר הפשרת17. למיטב ידיעתנו, חסרים מחקרים על קביעת חלון זמן הקפאה אופטימלי לתאי RPE שמקורם בתאי גזע. במחקרים שונים, התאים הוקפאו בשלבים שונים: חלק מהתאים הוקפאו זמן קצר לאחר המעבר או לפני מפגש או פיגמנטציה 8,15,18, בעוד שאחרים הוקפאו בנקודות זמן אחרות 9,19,20,21. יתר על כן, אין ראיות ברורות אם הפאזה או השלב של תאי RPE המשמשים לשימור בהקפאה משפיעים על תפקוד RPE לאחר הפשרה. במחקר הקודם שלנו, הדגמנו לראשונה שהשלב המעריכי של גדילת תאים (P2D5) הוא השלב הטוב ביותר לשימור בהקפאה של תאי RPE שמקורם בתאי תאי גזע עובריים עובריים (תאי גזע עובריים) במונחים של כדאיות התא והתאוששות התכונות והתפקודים התאיים17.
השיטה שהוקמה כאן שואפת לשמר בהקפאה RPE הנגזר מתאי גזע עובריים בשלב אופטימלי כדי להשיג את השימור הטוב ביותר מבחינת כדאיות התא ותפקודו לאחר ההפשרה. באמצעות בדיקת התיוג 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) כדי לזהות את השלב המעריכי של סינתזת DNA לפני שימור בהקפאה, תאי RPE מופשרים הציגו >80% כדאיות ושיעור התקשרות, ביטוי גנים ספציפיים ל-RPE, מורפולוגיה של תאים מקוטבים, הפרשת גורם שמקורו באפיתל פיגמנט, עמידות טרנסאפיתל מתאימה ויכולת פגוציטית 8,17,22. למרות שפרוטוקול זה מתמקד בתאי RPE שמקורם בתאי תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) ולא כל התאים הטיפוליים נשמרים בהקפאה בהקפאה בשלב המעריכי וניתן ליישם אותה על תאים טיפוליים רבים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo freezing container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>Biolife Solutions</td>
			<td>07930</td>
			<td>cryopreservation medium #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genxin</td>
			<td>Selcell</td>
			<td>YB050050</td>
			<td>cryopreservation medium #2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic stem cells</td>
			<td>provided by Wicell, USA</td>
			<td>H9 cell line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>AST-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryPLE Select</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XVIVO-10 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-743Q</td>
			<td>RPE culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells at the optimal stage

תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מקורות תאים מעולים לטיפול בתחליפי תאים אצל אנשים עם מחלות ניווניות ברשתית; עם זאת, מחקרים על הבנקאות היציבה והבטוחה של תאים טיפוליים אלה הם נדירים. כדאיות תאים משתנה מאוד והתאוששות תפקודית של תאי RPE לאחר שימור בהקפאה הן הבעיות הנפוצות ביותר. בפרוטוקול הנוכחי, שאפנו להשיג את קצב התאוששות התאים הטוב ביותר לאחר ההפשרה על ידי בחירת שלב התא האופטימלי להקפאה בהתבסס על תנאי הניסוי המקוריים. התאים הוקפאו בשלב המעריכי שנקבע על ידי שימוש בבדיקת התוויה 5-ethynyl-2′-deoxyuridine, אשר שיפרה את כדאיות התאים ואת קצב ההתאוששות לאחר ההפשרה. תאים יציבים ומתפקדים התקבלו זמן קצר לאחר ההפשרה, ללא תלות בתהליך התמיינות ארוך. השיטות המתוארות כאן מאפשרות שימור והפשרה פשוטים, יעילים וזולים של תאי RPE שמקורם בתאי תאי תאי גזע עובריים עובריים. למרות שפרוטוקול זה מתמקד בתאי RPE, אסטרטגיית הקפאה זו עשויה להיות מיושמת על סוגים רבים אחרים של תאים ממוינים.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a pigmented monolayer of cells required for maintaining the proper function of the retina1. RPE dysfunction and death are closely associated with many retinal degenerative diseases, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and Stargardt disease2,3. RPE replacement therapy is one of the most promising treatment regimens for these diseases4,5,6,7. A stable supply of donor RPE cells is vital for cell therapy. Human embryonic stem cell (hESC)-derived RPE cells are an ideal cell source for cell therapy because they mimic the function of primary RPE cells and can produce a theoretically unlimited supply8. However, the differentiation process is laborious and the shelf-life of the obtained RPE cells is relatively short because of subsequent epithelial-mesenchymal transition (EMT). Therefore, the cryopreservation of hESC-derived RPE cells is an indispensable step required for long-term storage and on-demand distribution9.
Cryopreservation-induced cellular damage can inadvertently compromise therapeutic efficacy10,11. Therefore, recent studies on cryopreservation have proposed that optimal cryogenic storage conditions should be determined when designing cell therapies12. Successful cryopreservation guarantees efficient cell recovery, high viability, and cell function restoration after the freeze-thaw cycle. However, previous studies on the cryopreservation of the adherent monolayers of mammalian cells have reported highly variable (35%-95%) survival rates after thawing13,14,15. Many factors considerably affect the outcomes of cryopreservation, particularly during the freezing stage16,17. Recent research showed that RPE cells frozen at different time points exhibited varied recovery after thawing17. To the best of our knowledge, studies on the determination of the optimal freezing time window for stem cell-derived RPE cells are lacking. In different studies, the cells were frozen at various stages: some cells were frozen shortly after passaging or before confluency or pigmentation8,15,18, whereas others were frozen at other time points9,19,20,21. Furthermore, there is no clear evidence of whether the phase or stage of RPE cells used for cryopreservation affects RPE function after thawing. In our previous study, we demonstrated for the first time that the exponential phase of cell growth (P2D5) is the best stage for the cryopreservation of hESC-derived RPE cells in terms of cell viability and the recovery of cellular properties and functions17.
The method established here aims to cryopreserve hESC-derived RPE at an optimal stage to achieve the best preservation in terms of cell viability and function after thawing. Using the 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) labeling assay to detect the exponential phase of DNA synthesis before cryopreservation, thawed RPE cells exhibited &#62;80% viability and attachment rate, RPE-specific gene expression, polarized cell morphology, pigment epithelium-derived factor secretion, appropriate transepithelial resistance, and phagocytic ability8,17,22. Although this protocol focuses&#160;on hESC-derived RPE cells and not all therapeutic cells are equally cryopreserved, the strategy of freezing in the exponential phase may be applied to many other therapeutic cells.

מחבר זרקור: פיתוח שיטה יעילה וישימה להקפאת תאי אפיתל פיגמנט ברשתית

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

Our lab aims to better understand the molecular mechanism of retinal diseases, with a focus on unmet medical needs of patients. We aim to develop effective treatments, such as stem-cell-based therapies, for them. Cryopreservation of stem-cell-derived RPE cells is an important step for RPE replacement therapy.Currently, the cells are frozen at various stages, resulting in highly variable survival rates for thawing. This is needed to determine the optimal cell stage for freezing these cells. Our protocol provides a simple, efficient, and inexpensive ways of freezing RPE cells by determining the exponential phase of RPE cells for freezing.It's less dependent of differentiated methods or cell lines.

כאן, תאי RPE שמקורם ב-hESC ב-P1D35 עברו ונזרעו בצפיפות של 105/cm2. תוך שבוע מהזריעה, המורפולוגיה המשושה והפיגמנטציה האופייניות אבדו בשלב הפיגור (כיומיים). תאי RPE אימצו מחדש בהדרגה את המורפולוגיה המשושה בשלב המעריכי (כ-5 ימים, איור 1A) ונכנסו לשלב ההאטה (כ-6 ימים) עם מורפולוגיה ...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage at JoVE.com

מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימור קריוגני יעיל של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע אנושיים.

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

המעבדה שלנו שואפת להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי של מחלות רשתית, תוך התמקדות בצרכים רפואיים שלא נענו של מטופלים. אנו שואפים לפתח עבורם טיפולים יעילים, כגון טיפולים מבוססי תאי גזע. שימור בהקפאה של תאי RPE שמקורם בתאי גזע הוא צעד חשוב לטיפול בתחליפי RPE.כיום, התאים מוקפאים בשלבים שונים, וכתוצאה מכך שיעורי הישרדות משתנים מאוד להפשרה. זה נחוץ כדי לקבוע את שלב התא האופטימלי להקפאת תאים אלה. הפרוטוקול שלנו מספק דרכים פשוטות, יעילות וזולות להקפאת תאי RPE על ידי קביעת השלב המעריכי של תאי RPE להקפאה.זה פחות תלוי בשיטות מובחנות או בקווי תאים.

cryopreservation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

481 Views.  Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. המעבדה שלנו שואפת להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי של מחלות רשתית, תוך התמקדות בצרכים רפואיים שלא נענו של מטופלים. אנו שואפים לפתח עבורם טיפולים יעילים, כגון טיפולים מבוססי תאי גזע. שימור בהקפאה של תאי RPE שמקורם בתאי גזע הוא צעד חשוב לטיפול בתחליפי RPE.כיום, התאים מוקפא...

Video: מחבר זרקור: פיתוח שיטה יעילה וישימה להקפאת תאי אפיתל פיגמנט ברשתית

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cell Dissociation and Optimal Cryopreservation Stage Determination

To begin, dilute a vial of thawed cold basement membrane matrix with 12 milliliters of DM EM F12. Mix the suspension well. Add one cover slip into each well of a 24-well plate.Then, pipette 250 microliters of the dilute matrix solution into each well. Discard the culture medium of the cultured hESC derived retinal pigment epithelial cell plates. Wash the plates two times with one milliliter of preheated PBS per well.Next, add 0.5 milliliters of the cell dissociation reagent to the wells of the culture plates, and incubate them at 37 degrees Celsius for 15 minutes to initiate digestion. After incubation, observe the cells under the microscope to confirm the end of digestion. Now with a one milliliter pipette, gently pipette the cell suspension up and down 10 times.Add preheated culture medium to dilute the suspension. Then, centrifuge it at 250 G for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant from the centrifuge tube.Then, re-suspend the cell pellet in two milliliters of the culture medium. Use a pipette to mix the cells 10 to 15 times. Filter the cell suspension through a 40 micrometer cell strainer.Next, count the retinal pigment epithelial cells. Aspirate the coating solution before plating. Then, add one milliliter of the culture medium into each well and seed the cells on the cover slips.After EDU incorporation and staining, capture the images of five random fields with a fluorescence microscope. Calculate the percentage of EDU positive cells. Then, plot the corresponding proportion time curves to generate a growth curve.Lastly, determine the freezing window from the exponential phase for each cell line. The retinal pigment epithelial cells initially lost their characteristic hexagonal morphology, but later regained it in the exponential phase of growth. When the cells were cultured for an additional week, cell proliferation decreased.EDU proliferation assay confirmed that P2 day five cells exhibited a higher proliferation rate, whereas P2 day 11 cells had entered the deceleration phase.

דיסוציאציה של תאי גזע עובריים אנושיים שמקורם בתאי גזע ברשתית דיסוציאציה של תאי אפיתל וקביעת שלב שימור הקפאה אופטימלי

Preservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells with Optimized Cryopreservation

To begin, dissociate the hESC-derived retinal pigment epithelial cells, prepare the cell suspension, and then count the cells. Now, centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant, then, resuspend the cell pellet in cryopreservation medium.Next, transfer one milliliter of the cell suspension to a 1.2-milliliter cryogenic vial. Place the cryogenic vials in a freezing container and freeze overnight at minus 80 degrees Celsius. Transfer the vials to liquid nitrogen for long-term storage.To thaw the frozen vials, first heat the culture medium in metallic beads heated to 37 degrees Celsius, pre-fill 10 milliliters of the warmed culture medium into a 15-milliliter tube. Now, remove the cryogenic vials from the liquid nitrogen and place them in an automated thawing system for rapid thawing. Drop 0.5 to one milliliter of the preheated culture medium into the cryogenic vial to ensure gradual cell adaptation.Then, pipet 1.5 to two milliliters of the cell suspension to the 15-milliliter tube with medium. Centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Then, discard the supernatant.Resuspend the pellet in two milliliters of warm medium. Load the cells in a hemocytometer and count them to determine the recovery and survival rates. Culture the thawed cells on basement membrane coated plates in a culture medium with Y27632.The retinal pigment epithelial cells that were frozen on day five in their exponential phase displayed a higher attachment rate after thawing. Relative to their characteristic hexagonal morphology, the cells frozen at other time points had a fibroblastic phenotype. P2 day-five cells displayed higher expression and more properly localized cell markers 28 days after thawing.It was noted that different cryopreservation media performed equally well in achieving high cell viability and attachment post-thawing.