Para comenzar, coloque los insertos de cultivo celular en una placa adaptadora de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Recubrir previamente el lado apical de los insertos con 100 microlitros de matriz extracelular de membrana basal o BME en medios de crecimiento enteroides. Recubra un inserto adicional para usarlo como control durante las mediciones de integridad de la barrera.
A continuación, incube el inserto recubierto a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono durante una hora. Una vez completada la incubación, aspire el medio de cultivo enteroide 3D. Coseche los enteroides ileales bovinos en 1 mililitro de medio de lavado helado.
Use un raspador de celdas para separar los domos y recogerlos en un tubo cónico de 15 mililitros. Con una punta de pipeta de 1 mililitro, triture 30 veces para generar fragmentos enteroides. A continuación, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para triturar aún más unas 40 veces para romper los fragmentos de enteroides.
Aumente el volumen del tubo a 10 mililitros con medios de lavado helados. A continuación, centrifugar el tubo a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, incluida la capa BME.
A continuación, por cada cuatro domos, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de enzima TrypLE express precalentada. Transfiera la mezcla a una placa de 24 pocillos e incube a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos. Pipetea suavemente la mezcla con una pipeta de 1 mililitro para descomponer aún más los enteroides.
A continuación, pipetea la mezcla con una pipeta de 200 microlitros para romper los fragmentos en células individuales. Utilice una jeringa de 3 mililitros equipada con una aguja estéril de calibre 22 para aspirar y dispensar la suspensión celular cuatro veces para lograr una suspensión de una sola célula. Con un microscopio, controle la disociación celular hasta que el 80% de los enteroides se descompongan en células individuales.
Ahora recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue cuatro volúmenes de medios de lavado FBS para apagar la reacción. A continuación, filtre los enteroides a través de un filtro celular de 40 micrómetros prerrecubierto dos veces en un tubo cónico de 50 mililitros.
Centrifugar la suspensión a 300 g durante cinco minutos para granular las células. Aspire el sobrenadante en el tubo de centrífuga de la suspensión de células enteroides, ileales bovinas disociadas. Vuelva a suspender el gránulo en un pequeño volumen de medio de crecimiento de organoides.
A continuación, utilice el método de exclusión del colorante azul de tripano y el hemacitómetro para determinar la viabilidad celular. Retire con cuidado cualquier exceso de solución de recubrimiento del inserto de cultivo celular. Siembre los 200 microlitros de la suspensión unicelular en la superficie apical de un inserto de cultivo prerrecubierto.
Ahora agregue 700 microlitros de medios completos FBS en el lado lateral basal del inserto. Mueva la placa unas 10 veces en forma de número ocho para distribuir uniformemente las celdas sobre el inserto. A continuación, coloque la placa en el calentador de platos en el armario de bioseguridad durante 10 minutos.
Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono a las 48 horas. Después de la incubación, reemplace los medios en los componentes apicales y basales con medios de crecimiento enteroide frescos. Al día siguiente, retire el medio de los compartimentos apical y lateral basal.
Lave cuidadosamente el inserto con PBS y reemplácelo con medios de diferenciación enteroides, complementados solo con inhibidores. La formación de la enterosfera se observó unas horas después del cultivo de las criptas bovinas plateadas. Después de dos días, el lumen de las esferas estaba bien definido, y se observaron estructuras en ciernes al cuarto día.
Los enteroides maduros se observaron al séptimo día. La inmunotinción de los enteroides 3D de siete días de edad mostró la presencia de diferentes linajes celulares. La proteína E-cadherina se localizó en la unión de adherencia.
Los enteroides fueron positivos para células enteroendocrinas y células Paneth productoras de lisozimas. Se observaron monocapas 2D confluentes en menos de una semana de cultivo.
